针刺对脑出血模型大鼠脑组织自噬相关蛋白p62、Beclin-1 表达的影响

刘 昊 杜 嘉 冯培培 阮 晨 张伟波 朱仲华 周 驰 李新伟

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一种常见且具有较高的死亡率和发病率的卒中亚型，每年占全球脑卒中的10%～15%[1]。幸存患者多因血肿引起神经元死亡，导致严重的神经功能缺损[2]。随着对ICH 脑损伤机制研究的日益深入，防治脑损伤、提高神经细胞存活率、保护神经细胞功能已成为ICH 机理研究和探索治疗方法的重要突破点。ICH后细胞死亡主要有三种类型，包括细胞坏死、凋亡和自噬性细胞死亡[3]。研究表明，血肿周边组织细胞中存在大量自噬小体结构，证实脑出血可以诱导自噬的激活[4]。自噬的激活很可能是细胞为了清除胞质中受损的细胞器和有害物质而发生的自我保护机制[5]。本研究通过建立自体血ICH 大鼠模型，运用免疫印迹、Western Blot 技术，以自噬相关蛋白p62、Beclin-1 为切入点，探究针刺对ICH 大鼠脑组织自噬表达的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 本研究所有研究流程遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定，符合浙江省立同德医院实验动物福利和伦理委员会标准（编号：XMSB20180007）。80只SPF级雄性Sprague-Dawley 大鼠（250～300g）购置于浙江省实验动物中心，许可证号SCXK（浙）2014-0001。饲养在室温和湿度人工可控条件下，光照周期12h/12h，给予自由标准饮食饮水。

1.2 主要仪器与试剂 立体定位仪（STW-3X，中国成都仪器厂）；石蜡切片机（CUT5062，德国SELL）；生物组织包埋机（TKY-BMB，湖北泰康医疗设备有限公司）；华佗牌针灸针（0.35mm×40mm，苏州医疗用品厂有限公司）；生物组织全自动脱水机（TKY-BMB，常州郝思琳医用仪器有限公司）；电泳仪（B1650001，上海迪申生物技术有限公司）；微量注射器（0406-029K，上海高鸽）；显微镜（BX50，日本Oympus）；低温离心机（002421，美国Thermo）。多聚甲醛（批号AR1068，武汉博士德生物有限公司）；PBS 缓冲液（批号AR0030，武汉博士德生物有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号P0012S，碧云天试剂盒）；PVDF膜（批号IPVH00010，德国Millipore）；兔抗p62 多克隆抗体（批号ab56416，英国Abcam）；兔抗Beclin-1多克隆抗体（批号ab62557，英国Abcam）；兔抗GAPDH 多克隆抗体（批号ab8245，英国Abcam）；羊抗兔IgG（批号ab6721，英国Abcam）。

2 实验方法

2.1 脑出血模型制备方法 根据大鼠立体定位图谱[6]（见插页图1）制备大鼠脑出血（ICH）模型[7]。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉。将其俯卧位固定于脑立体定向仪上，头皮中线切口以暴露颅骨和前囟点，在右侧前囟点后0.24mm，旁开3.5mm 钻直径1mm 的孔洞。50μL 自体血通过微量注射器注入到尾状核（坐标：AP：-0.24mm，L：3.5mm，D：6mm），以10μL/min 的速度缓慢注入自体血，留针5min 后缓慢退针（见插页图1）。切口缝合消毒。假手术组中大鼠仅接受ICH 模型的各项手术过程但不注血。

图1 大鼠立体定位图谱确定自体血注入位置

2.2 动物分组 将80 只SPF 级雄性SD 大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、非穴位组、针刺组，每组20 只。假手术组：仅接受ICH 模型制备手术过程，但不注血；模型组：50μL 自体血注入到尾状核制备ICH 模型，但不进行任何干预；非穴位组：模型组基础上针刺患侧非穴位；针刺组：模型组基础上针刺患侧“百会”透“曲鬓”。

2.3 针刺干预方法 针刺组：大鼠完全苏醒后，选择0.35mm×40mm 华佗牌一次性针灸针，根据《实验针灸学》[8]选取患侧“百会”、“曲鬓”穴位（见插页图2）。采用“百会”透“曲鬓”针刺法，透刺深度：1.5cm。留针30min，留针期间每5min 以180～200r/min 速度捻转1 次，共捻转3 次，每12h 1 次，连续针刺7 天；非穴位组：大鼠完全苏醒后，取患侧非穴位（定位：平行中线距“百会”穴1cm 处，见插页图2）采用透刺法，针刺透刺1.5cm，其他操作同针刺组。

图2 针刺示意图

2.4 指标检测

2.4.1 行为学评分 针刺干预7 天后进行行为学[7]评估：前肢放置试验（也称触须诱导前肢放置试验），轻轻抓起大鼠躯干，缓慢移动使之肌肉放松。通过接触桌子边缘来触碰大鼠触须，正常大鼠在刺激同侧触须时会将前肢放在桌子边缘。此过程重复10 次。前肢放置试验评分=前肢成功放置次数/总次数×100%。拐角试验，大鼠被置于一个由两面相连的木板组成的30°拐角中，为了离开拐角，大鼠必须左转或右转。评估10 次大鼠转动情况，每次间隔至少30s。拐角试验评分=左转数/全转数×100%。

2.4.2 大鼠脑组织p62 免疫组化检测 大鼠行为学评分结束后，腹腔注射倍量戊巴比妥钠麻醉大鼠，摘取脑出血半暗带区脑组织，用4%多聚甲醛固定，切成4μm 薄片进行免疫组化染色。切片脱蜡到水，将组织切片置于0.1mol/L 的枸橼酸溶液（pH=6.0）中修复，水浴20min，用组化笔圈定组织周围，滴加双氧水孵育20min，再加入封闭液封闭1h，加入兔抗一抗（p62，1：1000；Beclin-1，1:1500）在37℃孵育2h，再用山羊抗兔IgG 二抗（1：2000），在37℃下孵育30min，洗涤、复染、脱水、透明、封片。在400×显微镜下拍摄5 个视野。Image-Pro Plus 6.0 图像软件计算平均光密度值（n=10）。

2.4.3 大鼠脑组织Western blot 检测 用混合的RIPA 裂解缓冲液从脑出血半暗带区脑组织中提取总蛋白。蛋白浓度用BCA 蛋白检测试剂盒定量。离心后，用SDS-PAGE 电泳分离，将等量的蛋白质电转移到0.45μm 的PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入兔抗p62 一抗（1：1500）4℃过夜，再用HRP 标记羊抗兔IgG 二抗（1:2000）在室温下孵育2h。蛋白信号检测采用ECL 化学发光试剂，使用ImageJ 软件测量蛋白质条带的密度（n=10）。

2.5 统计学方法 数据应用SPSS 18.0 软件分析，组间比较采用ANOVA 方差分析，两两之间比较采用LSD-t 检验，数据以均值±标准差（±s）表示，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组ICH 大鼠行为学评分比较 造模后7 天，与假手术组比较，模型组大鼠出现明显神经功能缺损体征（P＜0.01）。针刺非穴位未改善ICH 大鼠神经功能缺损体征。与模型组比较，针刺干预能够明显提高ICH 大鼠行为学评分（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠行为学评分比较（%，±s）

表1 各组大鼠行为学评分比较（%，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与非穴位组比较，▲P＜0.01；假手术组：模拟ICH 制备过程但不注血；模型组：自体血诱导ICH 模型；非穴位组：模型组基础上予针刺非穴位干预；针刺组：模型组基础上予针刺“百会”透“曲鬓”干预

3.2 各组ICH 大鼠脑组织p62 蛋白表达量比较 免疫组化结果显示，与假手术组比较，脑出血模型大鼠p62 蛋白表达量明显增高（P＜0.01）。非穴位组与模型组p62 蛋白表达量相似。与模型组比较，针刺组大鼠脑组织p62 蛋白表达量明显降低（P＜0.01）。见表2、插页图3。

图3 各组大鼠出血半暗带区脑组织p62 蛋白表达量比较（免疫酶标染色法，n=10，×400）

表2 各组ICH 大鼠脑组织p62 蛋白表达量比较（±s）

表2 各组ICH 大鼠脑组织p62 蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与非穴位组比较，▲P＜0.01；假手术组：模拟ICH 制备过程但不注血；模型组：自体血诱导ICH 模型；非穴位组：模型组基础上予针刺非穴位干预；针刺组：模型组基础上予针刺“百会”透“曲鬓”干预；ICH：脑出血

3.3 各组ICH 大鼠脑组织p62、Beclin-1 蛋白表达量比较 与假手术组比较，脑出血模型大鼠p62、Beclin-1 蛋白表达量明显增高（P 均＜0.01）。非穴位组与模型组p62、Beclin-1 蛋白表达量相似。与模型组比较，针刺组ICH 大鼠脑组织p62 表达明显下调（P＜0.01），Beclin-1 蛋白表达量明显上调（P 均＜0.01）。见表3、插页图4。

图4 各组ICH 大鼠脑组织p62、Beclin-1 蛋白表达量比较（n=10）

表3 各组ICH 大鼠脑组织p62、Beclin-1 蛋白表达量比较（±s ）

表3 各组ICH 大鼠脑组织p62、Beclin-1 蛋白表达量比较（±s ）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与非穴位组比较，▲P＜0.01；假手术组：模拟ICH 制备过程但不注血；模型组：自体血诱导ICH 模型；非穴位组：模型组基础上予针刺非穴位干预；针刺组：模型组基础上予针刺“百会”透“曲鬓”干预；ICH：脑出血

4 讨论

在氧化应激或营养不足的情况下，细胞内的稳态是通过降解受损的细胞或细胞内的成分来维持的[9]。哺乳动物Beclin-1 通过与III 型磷脂酰肌醇3-激酶相互作用，促进磷脂酰肌醇3-磷酸的合成，从而促进脂膜的延伸、货物的募集和自噬小体的成熟，在自噬的形成中起着重要的作用[10-11]。p62 作为一种胞质蛋白，是链接泛素化蛋白与自噬机制的重要调控分子[12]。当自噬被激活时，溶酶体与自噬体结合，将自噬泡中自噬底物p62 以及其他蛋白质和细胞器降解，使得p62 水平降低；反之，p62 水平升高[13]。

脑出血后的脑损伤与炎症反应、凋亡激活和氧化应激有关，可导致不可逆转的神经元死亡[14]。近年研究表明，自噬途径在脑出血后的损伤中也起着重要的作用，自噬的调节可能成为脑出血治疗的新靶点[15]。研究发现，ICH 后血肿周围组织自噬被激活，从6h 开始，12～24h 达到高峰，3 天开始下降，7 天时自噬囊泡在神经元内高度聚集[16]。因此，自噬的激活可能在神经细胞死亡和脑出血的发生发展中起重要作用。

本研究发现，自体血诱导ICH 大鼠能够引起较严重的神经功能缺损体征，并上调脑组织Beclin-1蛋白和p62 蛋白表达，提高自噬的水平。荟萃分析表明，基于百会穴针刺干预急性脑出血大鼠能改善神经功能缺损评分，降低脑水含量[17]。与前期研究相一致，针刺干预可改善大鼠神经功能缺损体征，同时提高ICH 后自噬水平（上调Beclin-1，下调p62）。此研究结果验证了针刺能够上调ICH 大鼠自噬水平，并发挥其保护受损神经细胞作用。

综上所述，脑出血后能够引起自噬相关蛋白表达的增高，而针刺干预能够上调脑组织Beclin-1 蛋白，下调p62 蛋白表达，提高自噬水平，进而改善大鼠神经功能缺损体征。