间隔区寡核苷酸分型技术在分枝杆菌 菌种快速鉴定中的价值

朱晓燕 宋华峰 陈慧 吴敏娟 赵妮娜 胥萍

目前抗酸染色(AFS)和分枝杆菌培养仍然是临床诊断结核病的常用技术[1]。随着诊断技术的发展，核酸杂交探针、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)和DNA测序等分子技术越来越多的用于菌种鉴定[2-4]。通过核酸扩增可以直接检测呼吸道标本中的结核分枝杆菌复合物[5]，而不需要通过细菌培养检测方法，从而使长达2个月的结核病诊断缩短至6 h完成。非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacterium, NTM)肺病，会表现为咳嗽、疲劳和呼吸短促等症状，与结核分枝杆菌感染所致的临床症状相似，但治疗方案不同，临床鉴别诊断困难[6]。因此，有效地鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌具有重要意义。目前临床上以IS 6110为基础的限制性片段长度多态性(IS 6110-RLFP)[7]、多位点可变数目串联重复序列分析[multiple-locus VNTR(variable-number tandem repeats) analysis，MLVA]、Spoligotyping法等3种技术在分枝杆菌的检测中应用最广泛[8-9]。其中Spoligotyping法是一种基于PCR的检测结核分枝杆菌DNA直接重复区(DR)的基因分型方法，利用Spoligotyping法进行寡核苷酸分型，其结果可分析重复序列是否存在来鉴定分枝杆菌，并与建立的SITVIT2数据库进行比较。

传统的Spoligotyping法是采用固相膜杂交技术鉴定间隔子PCR产物，操作上需要进行变性、杂交、酶联、暗室发光显影等多个步骤，检测时间长[3, 10-11]。本研究采用的方法是寡核苷酸探针杂交的结核分支杆菌间隔区寡核苷酸分型方法，有如下改进措施：(1)将单链寡核苷酸探针固定在硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane, NC 膜)和尼龙膜上。(2)对DNA模板采用不对称的引物浓度扩增。(3)直接将单链PCR产物在芯片上与反应液进行混合反应，根据反应后的显色结果判断结核分枝杆菌的类型。该方法相对于传统Spoligotyping固有膜杂交法具有一定的优点，包括扩增产物为单链DNA片段，不需要杂交前变性，操作步骤少、实验周期短、效率高、显色无需在暗室发光显影，简单易行。本研究选择了苏州市第五人民医院2017年11月至2018年12月门诊和住院患者送检的痰液标本，拟通过此新方法对临床结核分枝杆菌进行检测并与非结核分枝杆菌进行鉴别诊断，从而来判断该方法是否能够更快速、更有效地提高诊断效能，以期为后续临床检测分枝杆菌提供快速、有效、准确的方法。

资料和方法

一、 研究对象

收集我院2017年1月至2018年12月间收治的疑似肺结核患者的痰液标本495份，其中男275例(55.6%)，女220例(44.4%)；年龄为14～85岁，平均年龄(46±14)岁。

二、标本采集

事先向患者交待好痰液标本留取注意事项，患者按要求在留痰前用清水漱口，然后用力咳嗽，将从深处咳出的痰液放于一次性无菌痰瓶，每份标本痰液量约3～5 ml，盖好盖子后立即送检。

三、仪器和试剂盒

BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)培养管(美国BD公司)，MGIT 960结核分枝杆菌快速培养系统(美国BD公司)，分枝杆菌罗氏培养基(简称“L-J培养基”；珠海贝索生物技术有限公司)，微孔板恒温振荡器(杭州佑宁仪器有限公司)、基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)、间隔区寡核苷酸芯片试剂盒(江苏猎阵生物科技有限公司)。

四、研究方法

将所有的痰液标本分别采用MGIT 960培养法、选择性培养基法(含有500 mg/L PNB罗氏培养基，简称“L-J培养基法”)及Spoligotyping法检测。

1.MGIT 960培养法：①标本处理时，首先将1～2 ml痰液转移至离心管中，用4%氢氧化纳(NaOH)液化， 然后进行振荡、混匀，再静置30 min，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)进行中和，再将标本离心后弃去上清，加入0.5 ml生理盐水，吹打、混匀。②接种时，首先吸取 0.5 ml已处理标本加入至MGIT 960培养管中，再将该培养管置入MGIT 960培养仪中进行培养。

2. L-J培养基法鉴定非结核分枝杆菌：① 菌液制备。先挑取生长良好的菌落，与磨菌管底部的PBS混合均匀，再配备不同浓度的菌悬液；②菌液接种。首先用接种环沾取1满环(约0.01 ml)不同稀释倍数菌悬液，用划线法均匀涂布于各培养基表面。③绝大多数非结核分枝杆菌菌株能在含有500 mg/L PNB罗氏培养基上能生长，而结核分枝杆菌却不能耐受。

3. Spoligotyping法：需要进行如下步骤。

(1)DNA提取：用分枝杆菌DNA核酸提取试剂盒提取DNA。将提取好的DNA置于2～8 ℃冰箱冷藏， 并在3 d内使用。阴性对照品作为质量控制的参照。(2)PCR扩增：利用不对称引物浓度扩增DNA模板。(3)分枝杆菌菌种鉴定芯片检测：在另外一个房间内进行杂交。(4)质量控制标准：阴性对照品的膜芯片除杂交质控探针(HC)、扩增质控探针(PC，用于质控杂交过程)位置有显色点外，其他位置均不显色，有显色则表明很有可能出现污染情况；阳性对照品的膜芯片。非结核分枝杆菌探针判读：当检测15种检测范围内的非结核分枝杆菌时，非结核分枝杆菌探针必定有信号。(5)结果判读：当HC和PC探针均为阳性，NC探针阴性时，判断结果是有效的。然后，将各应变识别探针的显色结果与阵列芯片的阵列图进行比较，并进行解读分枝杆菌的菌种类型。

五、统计学处理

结 果

一、L-J培养基法对分枝杆菌的鉴定结果

通过MGIT 960培养法及L-J培养基法检测495例疑似肺结核患者痰液标本，其中495例(份)标本检出结核分枝杆菌426例(86.1%)，包括人型405例，牛型21例；非结核分枝杆菌69例(13.9%)。

二、Spoligotyping法对分枝杆菌的鉴定结果

采用Spoligotyping法在495例(份)检测标本中检出结核分枝杆菌420例(84.8%)；非结核分枝杆菌75例(15.2%)，包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟-脓肿分枝杆菌、其他分枝杆菌(表1)。

表1 Spoligotyping法对495例(份)痰标本进行分枝杆菌检测鉴定的结果

表2 以MGIT 960培养法及L-J培养基法检测结果为参考标准评价Spoligotyping法在分枝杆菌菌种快速鉴定中的效能

注敏感度=a/(a+c)×100%；特异度=d/(b+d)×100%；阳性预测值=a/(a+b)×100%；阴性预测值=d/(c+d)×100%；符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%；a：真阳性例数；b：假阳性例数；c：假阴性例数；d：真阴性例数

三、以MGIT 960培养法及L-J培养基法检测结果为参考标准评价Spoligotyping法在分枝杆菌菌种快速鉴定中的效能

以MGIT 960培养法及L-J培养基法检测结果为参考标准评价Spoligotyping法在分枝杆菌菌种快速鉴定中的效能如下：敏感度为96.7%(412/426)，特异度为88.4%(61/69)，阳性预测值为98.1%(412/420)，阴性预测值为81.3%(61/75)，诊断符合率为95.5%(473/495)，Kappa值为0.821，具有较高的一致性(表2)。

讨 论

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，主要通过空气中的飞沫核传播，在发展中国家仍然是导致疾病死亡的主要原因[12-13]。虽然结核病的诊断有了迅猛进展，但仍然存在问题，主要原因是难以区分活动性结核病患者和已治愈的患者[14]。目前，仍靠传统的诊断方法，如Ziehl-Neelsen染色、荧光染色及痰培养，其中显微镜和培养仍然是结核病实验室诊断的主要支柱[15]。虽然结核菌素试验在过去的80多年时间里促进了结核病的诊断，但其往往会出现检测结果的假阳性、假阴性。抗酸染色阳性涂片要求每毫升痰液含104个抗酸杆菌，且抗酸染色无法识别其他抗酸微生物[16]。BACTEC 460和BACTEC MGIT 960快速培养检测技术缩短了培养时间，但不能识别结核分枝杆菌复合群或非结核分枝杆菌。如何进一步鉴定到菌种，需要建立一种更快速及准确、简便的检测方法。

基因芯片技术将核苷酸靶序列杂交并结合在硅片、玻片、硝化膜或塑料片上的探针上，能够大规模检测，具有高通量、高特异度[2, 12, 17]。 Chang等[4]选择13个M.tuberculosis特异性靶基因构建了快速诊断的基因芯片。采用膜阵列法，对疑似肺结核患者的痰标本进行基因芯片直接诊断，发现膜阵列法检测结核分枝杆菌的检出率较限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术、抗酸染色法高(分别为85%、62.5%、70%)，因而认为膜阵列法可直接检测痰中结核分枝杆菌，具有快速检测和亚种鉴定的优点，可用于结核病的防治。

本研究中非结核分枝杆菌占15.2%(75/495)，在这些非结核分枝杆菌中，堪萨斯分枝杆菌及胞内分枝杆菌分别占38.7%(29/75)、36.0%(27/75)。调查报告显示，非结核分枝杆菌分离株在所有分枝杆菌分离株中的比率已经从11.1%上升至22.9%[6, 18-19]。非结核分枝杆菌最常见的菌株是胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，但各国非结核分枝杆菌的分离率和菌株分布不尽相同[20-21]。本研究中鸟分枝杆菌复合群的构成比较低(2.6%)，以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌的构成比最高(分别为38.7%及36.0%)，可能一定程度上反映了苏州地区非结核分枝杆菌的种类分布情况。

综上所述，通过我们实验室的初步研究，笔者发现Spoligotyping法可以轻松、快速、准确地鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。该方法与传统的培养法相比较，其敏感度、特异度高，具有较高的符合率。该研究有望为我科进一步选择该方法用于结核病诊疗提供数据支撑和依据。