十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴镇痛作用研究

蒋雅娴，王志萍，李晓霞，苏佳昇，施显怡

(广西中医药大学 广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，广西 南宁 530001)

0 引言

石墨烯也可称为“单层石墨”,是二维的平面多环芳香烃原子晶体.近年来,石墨烯类材料由于其具有优良的电化学[1-3]、热学和机械性能[4-6]、被认为是材料科学和物理学的新星，而其独特的结构、优异的性能特点、良好的生物相容性[7]在生物医学领域也引起了极大的兴趣[8].

石墨烯作为一种新型制剂材料，比表面积达到2 630 m2/g，比大多数纳米材料的比表面积大1个数量级以上，巨大的比表面积使石墨烯具有较高的载药能力[9].Yang等[10]利用氢键作用实现抗肿瘤药物多柔比星(DOX)在氧化石墨烯上的高效负载，其负载量可达235%，远远高于其他传统药物载体.石墨烯具有导热性能良好的优势，其作为载体时导热系数可达600 W/mK[11].文献[12,13]研究发现,化学药物、DNA、RNA等均能通过π-π共轭、静电作用等非共价键作用,有效地固定在氧化石墨烯上,从而实现高效运载药物的功能.

十一方药酒是由广西中医药大学第一附属医院专家结合古方及临床经验所研发的院内制剂，由红花、续断、自然铜(煅)等中药组成，具有跌打止痛、消肿散瘀的功效，且临床应用和动物实验表明其疗效显著、毒性小、致敏性低[14-18].

但由于药酒在临床应用过程中存在难保存携带、稳定性差等缺点，本研究将十一方药酒与适宜的亲水性基质混匀后涂布在背衬材料上制成贴膏剂，制成基质载药量大、释药性能良好、皮肤刺激性小且易于使用的十一方巴布剂[19,20].

为研究十一方巴布剂及联用石墨烯的镇痛效果，本实验通过利用醋酸及热板致疼痛动物模型，证实石墨烯热敷贴与十一方巴布贴联用的镇痛活性，从而为开发效果好、安全性高的相关制剂提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司，HWS-12)；电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司，JM-A5002)；智能热板仪(成都泰盟软件有限公司，RB-200).

1.1.2 主要试剂及药品

水合氯醛(成都市科隆化学品有限公司，批号：2017030302)；硫化钠(成都市科龙化工试剂厂，批号：2016081601)；冰醋酸(成都市科隆化学品有限公司，批号：2017041301).

十一方巴布剂(自制，批号：20170701)；空白十一方巴布剂(自制，批号：20170701)；石墨烯热敷贴(烯旺新材料科技有限公司提供)；天和骨通贴膏(桂林华润天和药业有限公司，批号：20170223)；十一方药酒(广西中医药大学第一附属医院，批号：20170518).

十一方巴布剂制法：取CMC-Na1.6 g加入12倍量的水，于50 ℃水浴进行溶胀，制得A相；PVP-K30 10.0 g，加入0.2%尼泊金乙酯和20 mL十一方药酒，于50 ℃水浴进行溶解，制得B相；称取15.0 g甘油和1.0 g PEG400，加入13.0 g高岭土，搅拌均匀，制得C相.将A、B二相依次加入到C相中，高速搅拌均匀后，用涂膜机将药膏均匀地涂布于无纺布上，然后55 ℃恒温干燥8 h，取出，放冷，覆上保护膜，裁剪成7 cm×10 cm大小的贴片，包装，即得.

1.1.3 实验动物

SPF级KM小鼠200只，雌鼠150只，雄鼠50只，体重(20±2)g，购于广西医科大学实验动物中心，饲养于广西中医药大学动物房.合格证号:SCXK桂(2014-0002)，饲养环境温度为(23±2)℃，湿度为 40% ～60%，明暗交替周期为 12 h.实验前适应性喂养7天，自由取食饮水.

1.2 实验方法

1.2.1 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对醋酸致小鼠疼痛的作用[21]

取健康KM小鼠80只，雌雄各半，适应性喂养3 d后，按体重随机分为5组，即空白组(450 cm2·kg-1空白基质)、阳性组(450 cm2·kg-1天和骨通贴膏)、药酒组(27 mL·kg-1十一方药酒)、巴布剂组(450 cm2·kg-1十一方巴布剂)、联用组(450 cm2·kg-1十一方巴布剂联用石墨烯热敷贴).给药前24 h，各组小鼠腹部处用剃毛器进行约3 cm × 3 cm的脱毛处理，脱毛后饲养24 h，并检查脱毛区皮肤是否有损伤.24 h后使用5%水合氯醛(0.08 mL/10 g)进行麻醉，后按剂量在小鼠脱毛区皮肤给药6 h，连续给药7 d.末次给药后1 h，小鼠腹腔注射0.8%冰醋酸溶液(0.1 mL/10 g)，观察计数注射后小鼠出现第一次扭体反应的潜伏期(s)及15 min内出现扭体反应的次数.可按公式(1)计算各组给药小鼠扭体反应潜伏期延长百分率(%).

(1)

1.2.2 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对热板致小鼠疼痛的影响[22]

小鼠分组及给药方法同1.2.1，预热热板仪致至55 ℃，以小鼠放入热板中至出现舔后足的时间为该小鼠的疼痛阈值，取两次测定的平均值作为小鼠给药前的疼痛阈值(s)，若小鼠疼痛阈值超过30 s(痛觉不敏感)或小于3 s(痛觉过于敏感)则剔除.各组合格小鼠给药前用5%水合氯醛(0.08 mL/10 g)进行麻醉，后按剂量在小鼠脱毛区皮肤给药，每天给药6 h，连续给药7 d.末次给药后30 min、60 min分别测定各组小鼠的痛阈值.可按公式(2)计算各组小鼠给药后在不同时间点的痛阈值提高百分率(%).

(2)

1.2.3 给药剂量

空白组给予450 cm2·kg-1的空白基质；阳性组给予450 cm2·kg-1的天和骨通贴膏；药酒组给予与巴布剂等效剂量的药酒(27 mL·kg-1)；巴布剂组给予450 cm2·kg-1的十一方巴布剂；联用组给予450 cm2·kg-1的十一方巴布剂并联用石墨烯热敷贴，热敷时间为2 h.

1.2.4 数据统计学分析

2 结果与讨论

2.1 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对醋酸致小鼠疼痛影响的实验结果

联用组、巴布剂组小鼠15 min内扭体反应潜伏期均比空白组显著延长，差异具有统计学意义(**P<0.01，*P<0.05)，扭体次数也均比空白组显著减少(**P<0.01，*P<0.05).联用组与巴布剂组比较，小鼠15 min内扭体反应潜伏期无显著性延长，扭体次数也无显著性减少(*P>0.05)，但是联用组小鼠15 min内扭体反应潜伏期延长百分率较巴布剂组延长.结果说明十一方巴布剂及其联用石墨烯热敷贴均能缓解醋酸所致小鼠的疼痛，石墨烯热敷贴具有提高十一方巴布剂缓解醋酸所致小鼠疼痛作用的趋势.其实验结果如表1及表2所示.

表1 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对醋酸致小鼠扭体反应潜伏期的影响(x±s,n=10)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

表2 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对醋酸致小鼠扭体反应次数的影响(x±s,n=10)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对热板致小鼠疼痛影响的实验结果

联用组与巴布剂组小鼠在给药后30 min其痛阈值比空白组显著提高(*P<0.05)，60 min时两组痛阈值显著性提升(**P<0.01，*P<0.05).联用组与巴布剂组比较，小鼠给药后30 min和60 min的痛阈值均无显著提高(*P>0.05)，但联用组小鼠给药前后不同时间点的痛阈提高百分率较巴布剂组增长.结果说明十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴均能缓解热板所致小鼠的疼痛.其实验结果如表3及表4所示.

表3 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对热板致小鼠痛阈值的影响(x±s，n=10)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

表4 十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴对热板致小鼠痛阈值提高百分率的影响(x±s，n=10)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

由上述实验结果可知，十一方巴布剂及联用石墨烯热敷贴均能缓解热板所致小鼠的疼痛.但联用组与巴布剂组比较，小鼠给药后30 min和60 min的痛阈值均无显著提高(P>0.05)，其原因可能有：一为石墨烯热敷贴材质偏硬，在给药时由于实验动物的活动不能与巴布剂完全贴合，从而导致传热不均匀，二为石墨烯热敷贴使用时间不充分，未能提升十一方药酒巴布剂的经皮吸收，但是联用组小鼠给药前后不同时间点的痛阈提高百分率较巴布剂组大些，说明石墨烯热敷贴具有提高十一方巴布剂缓解热板所致小鼠疼痛作用的趋势.

3 结论

本研究以石墨烯类材料与传统的巴布剂结合——石墨烯热敷贴作为研究对象,开展了以石墨烯热敷贴联合十一方巴布剂对镇痛作用的药效研究.研究发现，联用组、巴布剂组小鼠15 min内扭体反应潜伏期均显著延长，扭体次数均显著减少给药后30 min的痛阈值均显著提高，给药后60 min的痛阈值提高有所变化.

实验表明,石墨烯热敷贴具有提升十一方巴布剂镇痛活性的趋势，石墨烯热敷贴尽管对十一方巴布剂的镇痛效果提升不显著，但其温热理疗作用可以增加患者肿痛部位的舒适感，提高患者对十一方巴布剂的顺应性.石墨烯良好的生物兼容性以及二维平面结构与药物的微妙作用仍需进一步开发[21]，方使其更好地应用于生物医药领域，这其中具体的作用机制仍需实验进一步去验证和探究.