消肿止痛颗粒对大鼠膝骨性关节炎软骨中NF-κB和ICAM-1表达的影响*

王守朝，陈兴涛，刘 涛 ，宋 渊，谢春华

(1.金昌市中西医结合医院 ，甘肃 金昌 737100； 2.甘肃省中医院， 甘肃 兰州 730050)

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)主要以膝关节疼痛、肿胀、关节积液、功能障碍，以及晚期的关节变形等为临床表现[1]。KOA的发病机制尚不明确，中医学认为风寒湿邪阻滞、经络不通、肝肾亏虚、筋骨失养是该病的基本病机[2]；西医学认为该病与年龄、性别、遗传、肥胖、急性损伤和慢性劳损等因素有关，主要以关节软骨的退变、软骨关节缘骨赘形成为病理基础，从而引起滑膜、关节囊和软组织的损伤和炎症反应[3]。不管是中医学还是发展迅速的西医学，对KOA的治疗都有自己独到的优势。本实验通过观察消肿止痛颗粒对改良Hulth法膝骨关节炎模型大鼠关节软骨的形态学改变、NF-κB mRNA及ICAM-1 mRNA表达情况的影响，以期为消肿止痛颗粒在治疗KOA方面的临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

10月龄SPF级健康Wistar 大鼠80只，雌雄各半，体质量(300±20)g，生产许可证号为SCXK(甘)2015-0035，由甘肃中医药大学实验动物中心提供。安静状态下适应性饲养1周，饮水、饲料充足，光照周期12L/12D(7：00-19：00)，温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%。

1.2 药品、试剂与仪器

消肿止痛颗粒处方组成：当归、生地黄、川芎、白芍、桃仁、红花、三七、青皮、木香、泽兰、独活、秦艽。药液由甘肃省中医院制剂科生产，批号20051122。硫酸氨基葡萄糖片，0.314 g/片，新兴同仁药业有限公司产品，批号16030；注射用青霉素钠，400万单位/支，华北制药股份有限公司产品， 批号S1207502。PrimeScript TM RT reagent Kit逆转录试剂盒(批号DRR037)、SYBR® Premix Ex Taq TM实时定量PCR试剂盒(批号RR820A)，均为宝日医生物技术有限公司产品； E.Z.N.A. Total RNA KitⅠ，美国Omega公司产口，批号R6834-01；PBS缓冲液，北京蓝博斯特生物科技有限公司产品，批号NYJ0985；TRIZOL试剂， Invitrogen 公司产品，批号16105；琼脂糖，上海川翔生物科技有限公司产品，批号0000101527；EDTA缓冲液，上海西唐生物科技有限公司产品，批号000152532。热电88400V60型-80 ℃超低温冰箱，美国 Thermo 公司产品；OLYMPUSCH光学显微镜，产地日本；CT14RD型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品；S1000型PCR热循环仪、荧光定量PCR仪，均为美国 Bio-Rad 公司产品 。

1.3 动物分组与模型的建立

将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型对照组、硫酸氨基葡萄糖片组、消肿止痛颗粒组4组，每组20只。适应性喂养1周。1周后，按照文献[4]方法造模。采用质量分数为100 g/L 的水合氯醛按3.5 μL/体质量腹腔内注射麻醉大鼠，固定于手术台上，选取左后侧膝关节为手术区域，常规备皮，消毒,取髌旁内侧纵切口(切口长约1.2 cm)。假手术组仅切开皮肤，然后直接缝合。其余各大组采用改良Hulth法造模：用小尖刀片逐层依次切开皮肤、筋膜，打开关节腔，拿镊子将髌骨向外侧推至脱位，屈曲膝关节，暴露前交叉、内侧副韧带，先切断前交叉、内侧副韧带，再摘除内侧半月板，保护好周围其他组织，无菌纱布按压止血、以生理盐水冲洗关节腔并逐层缝合，不包扎。术后每只大鼠给予40万单位青霉素臀大肌肌内注射，连续7 d。造模后大鼠全部存活，手术伤口未见红肿、渗出，术后8～10 d基本愈合。伤口愈合后每日驱赶大鼠活动 0.5 h，驱赶8周后KOA造模成功。

1.4 给药方法

按照《中药药理研究方法学》[5]中的方法，根据人和大鼠的计量折算系数确定给药量。消肿止痛颗粒组大鼠的剂量约为7 μg/(g·d)，给予消肿止痛颗粒1.87 μL/(g·d)灌胃；硫酸氨基葡萄糖片组给予硫酸氨基葡萄糖片170 μg/(g·d)灌胃；模型对照组给予等体积的质量分数为9 g/L的生理盐水灌胃；假手术组自由饮水。共灌胃8周。

1.5 检测指标

灌胃结束，处死大鼠并取样。

1.5.1 关节软骨的肉眼大体形态观察

按照文献[6]方法进行。在光线充足的条件下，逐层切开大鼠左后侧膝关节皮肤、筋膜、关节囊，充分暴露膝关节，肉眼观察关节软骨表面破坏程度、光泽及颜色等。

1.5.2 关节软骨光镜观察

按照文献[7]方法进行。取右后肢内侧股骨髁关节面软骨，冲洗干净后放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定，固定2 d，放入质量分数 150 g/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)脱钙液中进行脱钙处理。每周更换1次EDTA脱钙液。脱钙4周后，石蜡包埋(包埋时注意控制温度和切面完整)，切片，HE染色，在100倍光镜下观察。按照Mankins标准对HE染色进行评分[8]。

1.5.3 RT-PCR法检测各组软骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA的表达

按照文献[9]方法进行。

总RNA提取：将预先冻存的软骨组织从液氮罐中取出，取50 mg软骨组织，DEPC水冲洗，捣碎置于350 μL的组织裂解液(TRIZOL)内，用微量组织匀浆器行匀浆处理，匀浆后加650 μL TRIZOL。裂解完成后加入0.2 mL的氯仿，管盖盖紧后颠倒混匀15 s。冰上静置20 min，会看到氯仿和TRIZOL已经分离为上、下两层，但氯仿层比较混浊，轻轻放入4 ℃ 离心机，离心10 min；离心后，会看到明显的分层，其中上清液中含有RNA。吸取上清(切勿将中、下层吸进)，按照吸取的上清容积加入异丙醇(异丙醇与上清液的比例为1∶1)，混匀，静止10 min后再次离心10 min。离心后，底层出现乳白色的固体沉着，倒掉上清液，加体积分数750 mL /L的酒精(预冷)，吹打，离心2 min。倒掉上清液，加体积分数750 ml /L的酒精(预冷)，吹打，离心2 min。自然干燥10 min，加入20 μL的DEPC水，吹打，混匀，即得总RNA。

逆转录反应：提取总RNA后，采用颈环结构的MegaPlexTMRNA反转录引物混合物进行反转录，按照TaKaRa公司逆转录说明书PrimeSciptTMRT Waster MIX 操作进行逆转录。反转录体系如下：PCR反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃终极延伸1 min，共40个循环。观察扩增曲线和溶解曲线，溶解曲线以单峰为佳。逆转录合成cDNA反应体系见表1。逆转录反应设置：在 PCR 仪上，16 ℃，10 min； 37 ℃，30 min；65 ℃，5 min。

表1 逆转录合成cDNA反应体系

实时定量荧光PCR：反转录结束后按照RT-PCR反应体系进行扩增，以GAPDH作为内参对照，进行PCR产物的半定量分析，引物序列见表2。PCR反应体系PCR反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃终极延伸1 min，共40个循环。观察扩增曲线和溶解曲线，RT-PCR结果采用相对定量2-ΔΔCt法计算表达量。PCR反应体系见表3。

表2 引物序列

表3 PCR反应体系

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠关节软骨的大体形态观察

假手术组大鼠的关节软骨面光滑、透明，色泽如常，关节面完整、无裂隙、无溃疡，关节表面无明显变化。模型对照组大鼠的关节表面粗糙不平，色泽灰暗，软骨透明度明显降低，有不同程度软骨糜烂、溃疡形成，甚至出现剥脱、缺损、软骨下骨质暴露现象。两个药物组大鼠的软骨透明度、色泽较模型对照组明显改善，软骨表面粗糙，整体情况较假手术组略差，个别区域颜色偏暗。

2.2 各组大鼠关节软骨光镜观察

假手术组大鼠的关节软骨表面光滑，染色清晰，软骨表层、软骨移行层、辐射层和钙化层清楚可辨，细胞排列整齐，层次清晰，染色质分布均匀，细胞核清晰。模型对照组大鼠的关节软骨表面粗糙，表层变薄甚至消失，部分区域有绒毛状表现，裂隙较多可达深层，部分区域的细胞核固缩、坏死，钙化层细胞紊乱排列呈簇状，潮线不完整或消失。两个药物组大鼠的软骨组织损伤程度好于模型对照组,但比假手术组损伤程度严重：不规则排列的软骨细胞在部分区域仍可见，但较模型对照组少见，各层界限仍欠清楚，镜下个别区域存在簇集现象,基质染色较均匀，个别潮线不完整。各组大鼠关节软骨HE染色光镜下病理切片见图1，Mankins评分对比见表4。

图1 各组大鼠关节软骨光镜下病理切片(HE，×100)

表4 各组大鼠关节软骨Mankins评分对比 分，

注：与假手术组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.3 各组关节软骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表达对比

与假手术组对比，模型对照组关节软骨组织中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表达明显升高(P<0.05)。与模型对照组对比，消肿止痛颗粒组、硫酸氨基葡萄糖片组关节软骨组织中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与硫酸氨基葡萄糖片组对比，消肿止痛颗粒组NF-κB、ICAM-1 mRNA表达差别有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠关节软骨中NF-κB mRNA、ICAM-1 mRNA表达对比

注：与假手术组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0. 05；与硫酸氨基葡萄糖片组对比，△P<0. 05。

3 讨 论

膝关节骨性关节炎是一种慢性、进行性的关节软骨退行性疾病。X线片表现为关节间隙变窄，关节周围骨质硬化，以及部分或大量骨赘形成。临床主要表现为关节疼痛，肿胀，僵硬感，由疼痛引起的活动受限、关节畸形等。与软骨相关的软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者间合成和分解代谢失衡[10]是KOA发病的关键，力学和生物学因素的共同作用是其发病的主要根源。正常人软骨的合成和分解处于动态平衡状态，但KOA患者关节软骨的代谢处于负平衡，即分解大于合成，平衡失调破坏了患者的关节软骨[11]，从而导致关节软骨变性、破坏，软骨下骨发生硬化，关节周缘骨质增生，滑膜肥厚增生，关节囊挛缩及肌肉萎缩等[12]。KOA的发病率随着年龄的增长而增长，女性较男性多见。来自流行病学的调查显示：60岁以上的人群中，约50%的人在X线片上可看到KOA表现，35%～50%有临床表现；75岁以上的人群中，80%有KOA症状[13]。据有关数据显示：超过50岁的人群中，KOA导致长期残疾的几率仅次于排在第一位的心血管疾病。该病有高达53%的致残率，给社会和家庭造成沉重的经济负担[14]。因此，探索一种符合我国国情、行之有效的治疗方法势在必行。

NF-κB通路在炎症因子的表达中起关键作用。在未受刺激的情况下，NF-κB二聚体被κBs抑制剂(IκB)隔离在细胞质中，通过用IκB的锚蛋白重复结构域掩盖NF-κB蛋白的核定位信号而将NF-κB蛋白保留在细胞质中[14]。激活后，IκB被磷酸化，导致靶向蛋白酶体降解并释放NF-κB蛋白。随后，NF-κB蛋白被移入细胞核并开启其启动子或其他位点中具有NK-κB结合元件的特定基因的表达[16]。激活IκB激酶(IKKs)以响应几个信号使IκB蛋白磷酸化并引起它们的降解，这使得游离的NF-κB复合物从细胞质转移到细胞核中并引发靶基因反式激活[17]。 NF-κB信号通过各种作用广泛参与骨关节炎(osteoarthritis,OA)的病理生理过程，并在衰老和炎症过程中在OA软骨细胞中被激活[18]。 NF-κB通路对于诱导各种炎症相关因子至关重要，包括Mmp蛋白，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，IL-1β和TNF-α，这些诱导的细胞因子进一步激活信号级联反应。ICAM-1是介导OA发病过程中单核细胞粘附和浸润的重要粘附分子。ICAM-1是一种诱导型表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，可介导粘附依赖性细胞间相互作用[19]。 ICAM-1的胞外结构域在白细胞从血管迁移到炎症部位的过程中起着至关重要的作用。在OA患者的滑膜中已显示出ICAM-1的上调，这可能是白细胞募集到滑膜组织中的重要调节因子。 此外，通过降低关节液中ICAM-1的水平能够抑制OA的炎症反应和改疼痛症状。研究还发现，ICAM-1基因启动子上含有NF-κB结合位点[20]。在OA的形成和发展中，NF-κB还作为关键的核转录因子调控ICAM-1的转录与表达，使ICAM-1表达增多，吸引单核巨噬细胞、淋巴细胞的侵入和聚集，加重局部的炎症反应和炎症损伤。

骨性关节炎属中医学“骨痹”范畴。骨痹首出于《素问·痹论篇》，指气血不足或亏虚、风寒湿之邪伤于髓骨而表现出的病症。《素问·长刺节论篇》云：“病在骨，骨重不可举、骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”指出骨痹的主要临床症状是骨骼酸痛，身体困重，四肢沉重不易举。骨痹的病位在骨，与五脏关系密切，主要与肝脏、脾脏、肾脏相关，可涉及筋骨、关节、肌肉。中医认为骨痹与“虚”“邪”“瘀”关系密切。肾主骨生髓、肝主筋、脾主肌肉。人到中年后，会逐渐出现肝肾亏虚、骨节失养，又因膝关节长期劳损，骨不生髓，髓失骨养，复加瘀阻、风寒湿邪侵袭，遂致经络不畅、气血不通故而发病。本虚标实是KOA的主要病机特点。消肿止痛颗粒的主要作用是补肾强筋、活血通络，由当归、生地黄、川芎、白芍、桃仁、红花、三七、青皮、木香、泽兰、独活、秦艽组成，可祛风除湿、活血止痛，主要用于治疗肝肾亏虚、筋脉瘀滞型的骨痹之病。当归、川芎活血祛瘀，消肿止痛；桃仁、红花加强当归、川芎破瘀血、生新血之力；三七加强行瘀、镇痛、消肿功效；青皮、木香行气散结止痛；生地黄、白芍凉血消瘀；泽兰消散痈肿，减少渗出，促使肿胀消退。诸药合用，共奏活血化瘀、消肿止痛之效。 综上所述,消肿止痛颗粒可通过降低NF-κB、ICAM-1mRNA含量表达，保护KOA关节软骨的病理改变，从而减轻关节损伤，保护关节软骨，延缓KOA病情的进展。