男性不育患者HPV感染与精液指标的相关性研究*

骆 峻,石 亮,史恒川,丁利军,张 星,王国平

(1.江苏卫生健康职业学院中心实验室，江苏南京 210029；2.江苏省省级机关医院检验科，江苏南京 210002；3.南京大学医学院附属鼓楼医院男科，江苏南京 210001；扬州市中医院：4.泌尿外科；5.检验科，江苏扬州225009)

人乳头瘤病毒(HPV)与女性宫颈癌的相关性已被阐明，德国科学家豪森因此获得2008年诺贝尔医学/生理学奖。更多研究显示HPV感染与90%的男性肛门癌、50%的阴茎癌、10%～72%的口腔癌等其他癌症相关[1]。因为HPV主要通过性传播，男性HPV感染情况及感染后果日益受到关注，研究证实在男性精液、冠状沟、阴茎体部均可检出HPV[2]。近年，国外学者开展了HPV感染与不孕不育相关性的研究，但尚未形成完全一致性的观点[3]。国内男性人群这方面研究数据相对较少，本研究依据男性不育患者精液HPV检出情况分组，观察HPV感染与精液指标的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年10月至2018年4月在南京鼓楼医院男科门诊和扬州市中医院泌尿男科因不育为主诉求诊的男性患者精液样本共计436例，患者年龄最小22岁、最大45岁，平均(31.41±5.26)岁。

1.2仪器与试剂 荧光定量PCR仪(Studio 5，美国ABI)；CASA分析仪(BEION S3，上海北昂)；流式细胞仪(ACCURI C6，美国BD)；全自动生化仪(BS-350E，深圳迈瑞)；HPV试剂(湖南圣湘，26分型)；DNA提取试剂盒(湖南圣湘)；DNA碎片分析试剂(星博生物)；精浆生化试剂(南京欣迪)；抗精子抗体试剂(南京欣迪)；生殖道感染指标试剂盒(上海仁度)。全部实验依据世界卫生组织(WHO)精液分析手册第5版标准，参照仪器及试剂说明书进行。

1.3方法

1.3.1样本采集与前处理 患者均于2～7 d禁欲后手淫法采集精液样本，精液置37 ℃恒温水浴液化30 min后轻柔混匀(不液化样本加1%的10 mg/mL糜蛋白酶继续水浴30 min)；记录及测量精液体积、外观、液化时间、液化状态、黏稠度、pH等指标。精液常规分析、精子形态学分析、精子DNA碎片指数检测检测均随即进行；精浆生化免疫相关检测采用3 000 r/min离心10 min分离精浆后检测；HPV分型检测取500 μL精液样本-20 ℃保存，集中检测。

1.3.2DNA的提取 取500 μL精液样本至1.5 mL离心管，1 200 r/min，2 min；弃上清，加500 μL生理盐水充分混匀，1 200 r/min，2 min；弃上清，加入50 μL样本释放剂(圣湘生物S1013)，充分混匀；100 ℃金属浴10 min，1 200 r/min，2 min后取上清液待用。

1.3.3HPV分型检测 采用湖南圣湘HPV-DNA 26分型试剂盒，PCR-荧光探针法，检测包括26种亚型的HPV-DNA(HPV6、11、16、18、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、66、67、68、73)。试剂室温平衡，混匀备用；配制PCR反应液(取7种HPV PCR反应液n×38 μL分别与7份n×2 μL酶混合液，充分混匀成PCR-混合液，瞬时离心后备用)；加样(包括待测样本、阴性对照、阳性对照)每样本每管10 μL，各7管；各反应管分别加入40 μL上述已配制好的7种PCR-混合液，盖上管盖，上机检测。扩增条件：50 ℃ 2 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45个循环,25 ℃ 10 s。

2 结 果

2.1精液样本HPV感染情况 436份精液样本经HPV分型检测，共检出阳性患者28例，阳性率6.4%，其中有2例检出两个型别重复感染，共检出HPV型别30个，其中高危型17个、低危型13个，型别结果见表1。

表1 阳性样本HPV型别分布

2.2HPV感染与精液指标关系 按照HPV分型检测结果，将436例患者分为HPV阴性组(n=408)、hr-HPV(高危型)阳性组(n=16)、lr-HPV(低危型)阳性组(n=12)。各组间精液常规、精子形态学、精浆生化、传染病学方面20余项主要临床常用指标的差异性进行比较，其中包括精液量、精子浓度、精子总数、前向运动(PR)、非前向运动(NP)、不动(IM)、正常形态精子率、头部缺陷率、中段缺陷率、尾部缺陷率、顶体完整率、精浆锌、精浆糖苷酶、精浆谷氨酰转肽酶、精浆果糖、DNA碎片指数(DFI)、高染色性精子指数(HDS)为计量指标；抗精子抗体(ASAB)、抗弓形虫抗体(ATAB)、沙眼衣原体(CT)、生殖支原体(MG)、淋球菌(NG)、解脲支原体(UU)感染率为计数指标。结果发现，各组间PR、中段缺陷率指标比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 精液HPV感染情况与精液指标关系比较

续表2 精液HPV感染情况与精液指标关系比较

续表2 精液HPV感染情况与精液指标关系比较

注：-表示无数据

3 讨 论

HPV是常见的性传播疾病之一，在不同年龄、地区、种族、社会经济地位的男性中，均有不同程度的HPV感染，尤其是性生活活跃且无保护性措施的男性中可检测到HPV的存在[4]。由于大多数的HPV感染为无症状或亚临床症状感染，HPV健康携带者已成为主要的传染源。针对此，本研究对南京及周边地区436例男性不育患者进行了精液HPV的检测。

本研究发现，男性精液HPV感染型别分布较广，低危型和高危型型别分达6种和8种，常见的高危型别有52、58、16等，与邓健康等[5]、李晓莹等[6]及雷雨等[7]的报道一致。而且，男性精液HPV感染型别与我国女性常见型别总体相符，亦证实男女之间可能存在HPV的相互传染。

尽管有研究显示，精液中HPV感染对精子活力和DNA完整性没有明显影响，且HPV感染后精子的受精率、卵裂率、优质胚胎率及妊娠率亦无明显改变[8]，但绝大多数研究显示，不育男性HPV感染率往往高于生育男性，且HPV阳性组的精子活力、正常形态精子百分率明显下降，抗精子抗体阳性率增加，且一些HPV感染者往往存在多重感染[9-12]。本研究发现，Hr-HPV组PR指标显著低于lr-HPV组和HPV(-)组，中段缺陷率指标显著高于lr-HPV组和HPV(-)组，与国内外绝大多数研究结果相符。已有研究显示[4]，HPV DNA可进入精子头部及精液中的脱落上皮细胞中。并有研究通过荧光原位杂交技术在精子赤道区，观察到HPV L1衣壳蛋白与精子细胞跨膜结合蛋白聚糖(CD138)形成铰链，从而吸附于精子表面[13]。HPV侵入精子，病毒DNA可能与精子DNA发生整合，HPV相关蛋白可能干扰精子的正常代谢，导致精子功能异常，使男性生育能力降低。不同研究报道的结果差异，可能与研究人群、取样方法、取样部位、检测方法等有关[14]。

HPV最重要的传播途径是性接触，女性和男性均会感染HPV。相对女性HPV感染与致癌因素受重视程度而言，男性HPV感染引起的疾病并未引起足够的关注。有实验研究证实在男性龟头、冠状沟、阴茎表面皮肤、阴囊部皮肤、前列腺等部位均能检出HPV。国内外学者对女性HPV感染者的男性伴侣进行HPV检测，结果有33%～83%的阳性率[15-17]，这一结果是显著高于一般人群的。但是，HUANG等[18]对男性HPV感染者的女性伴侣进行检测时，hr-HPV的检出率只有5.32%，似乎又与常规的观点不符，需要进一步研究探讨两者关系一致性和不一致性的具体原因。

国外研究报道男性一般人群HPV感染率为2.00%～31.00%，男性不育人群为10.00%～35.70%，阳性率差距很大[2]，本研究436例患者中HPV总阳性率6.18%，处于较低水平。但正如女性HPV在不同地区和不同人种之间感染率差距巨大一样[19]，男性的HPV感染率是否也与区域、人种息息相关，目前尚缺少这方面的大数据研究。此外，不同研究所用检测方法灵敏度不一，检测型别是否全面也会影响到检出率。一般认为分型至少应在20种以上，包含WHO确定的14种高危型和常见低危型的检测方法是较为全面的[20]。

近年来，较多研究指出男性精液中检出HPV与精子质量下降[21]、与特发性精子减少症存在显著相关性[22]，还可能对早期的胚胎发育和滋养层细胞产生影响[23-24]，可能导致胚胎植入成功率降低和早期流产率增高[25]，从而影响辅助生殖的成功率。所有这些研究，虽然尚没最终定论，但也提示应多关注精液HPV检测重要性。本研究也得到hr-HPV组PR低于其他组的结果。这些发现还导致人们对存储在精子库中精子质量的担忧。早在2000年加拿大医学协会杂志就刊登了BASKY[26]的观点，他认为精子捐献者应当接受HPV检测，这对我国正在快速发展中的精子库建设亦有所借鉴。

本研究及众多文献结果提示，男性亦是HPV感染的高危人群，特别是有生育愿望的夫妇，更应关注HPV感染对男性生育力的影响。而且，有研究显示，男性HPV感染与性传播疾病、不育、生殖器肿瘤、女性性伴侣的HPV感染均有一定的关系[12]，因此，应采取一定的措施，降低男性的HPV感染率，其中包皮环切、减少性伴侣数目、使用安全套可能是有效的措施。研究显示[27]，潜伏感染HPV的男性患者其性伴宫颈感染率相对更高，说明对于潜伏感染患者其性伴宫颈HPV的检查更有意义。亦有研究发现[7]，性伴侣包皮过长或包茎是女性HPV感染的独立危险因素。因此，对HPV感染男性应检查其包皮状态，如果包皮过长，应尽早行包皮环切术，因为其能明显降低男性HPV感染率，并且较早进行包皮环切术效果更显著[28]。尽管HPV感染对生育能力的影响机制尚未完全阐明，男性精液HPV感染的临床意义也值得进一步研究和探讨[29]，但其对男性生育力的影响和对女性的危害已被绝大多数学者所接受，未来我国男性人群HPV感染的大数据研究及不孕不育病因学研究将对我国提高新生儿出生率的国策起到响应和推动的积极作用。

4 结 论

本研究对436例男性不育患者精液HPV检出情况与精液临床相关指标进行比较研究，发现精子运动活跃度PR指标和精子中段缺陷率指标与HPV感染存在相关性。在此基础上，较全面的探讨了男性HPV感染对不育的影响，认为男性也不应当忽视HPV的相关检测，尤其是有生育需求者和不育门诊就诊者。因为，HPV感染可能是男性不育的危险因素之一。