微小RNA-340对肝细胞癌细胞转移和侵袭力的影响

袁成良，邹 宁，刘朝红，邹颜矫

(德阳市人民医院检验科，四川德阳 618000)

肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的70%～85%，是全球癌症最常见的死亡原因之一[1]。治疗HCC包括手术切除和肝移植，但这仅仅对一小部分早期诊断的HCC患者有效[2]。造成这种结局的主要原因是HCC的高侵袭性和肝内和(或)肝外转移[3-4]。目前对HCC转移和侵袭的机制研究多集中在已知基因上，但有不少学者通过对微小RNA(miRNA)的研究来了解HCC的生物学机制，并且收益颇多。本实验通过miR-340转染，利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Transwell侵袭实验和蛋白质免疫印迹(Western blot)等技术来检测上皮细胞间质转化相关分子、基质金属蛋白酶(MMP)及核转录因子-κB1(NF-κB1)的表达，进一步探讨miR-340对HCC细胞转移、侵袭的影响及通过何种途径来调控其转移和侵袭，为预防、诊断和治疗HCC提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 人HCC细胞株HepG2、MHCC-97L和永生化的健康人输卵管上皮细胞株FTE187从美国菌种保藏中心购得。

1.2仪器与试剂 ABI7500实时PCR仪购自美国赛默飞公司；DMEM培养基、胎牛血清均从美国Gibco公司购得；LipofectamineTM2000 试剂购自美国Invitrogen；qPCR试剂盒购自荷兰Qiagen公司；含细胞外基质蛋白的基质胶从美国BD生物购得；包被的Transwell培养皿(8 mm孔径)购自美国Corning公司；ELISA试剂盒从武汉优尔生生命科学装备有限公司购得；Western blot所用裂解缓冲液、基于二喹啉甲酸比色法(BCA)的蛋白检测试剂盒、化学发光(ECL)试剂均购自中国生物技术研究所碧云天；蛋白酶抑制剂从德国默克购得；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)从美国Millipore购得；NF-κB1抗体、羊抗兔IgG二抗和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自美国细胞信号传导技术公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 人 HCC细胞株HepG2、MHCC-97L和永生化的健康人输卵管上皮细胞株FTE187均用DMEM培养基培养，严格按照说明书进行。

1.3.2miRNA瞬时转染 HepG2 和MHCC-97L细胞株均转染miR-340作为miR-340组。两个细胞株不转染miR-340为对照即miR-NC组。24 h后用LipofectamineTM2000 试剂将50 nmol/L的miR-340转染入细胞。

1.3.3Transwell侵袭实验 用含细胞外基质蛋白的基质胶包被的Transwell培养皿(8 mm孔径)来评估细胞的侵袭力。细胞在无血清培养液中培养24 h,2×105个细胞悬浮于100 μL无血清DMEM，然后接种在顶室中，在下室中加入600 μL含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM。于37 ℃，5%CO2环境中孵育24 h后，用棉签擦掉留在膜表面上的细胞，然后穿透细胞在甲醇中固定，再用0.1%结晶紫染色。用相差显微镜观察并记录侵袭到下层培养池中的细胞数目。

1.3.4qPCR检测指标的表达情况 采用qPCR检测miR-340和5种mRNA包括E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、MMP-2和MMP-9，用Trizol试剂提取细胞总RNA。2 μg RNA用于qPCR，用qPCR试剂盒进行RNA转录和扩增。SYBR GreenⅡ用来作为荧光信号，ROX作为对照荧光。mRNA的逆转录在Applied Biosystems GeneAmp PCR系统9700上进行，实时PCR在ABI7500实时PCR仪上进行。所有的样本都同批检测，以避免批间差。各样品均做3份平行试验取其均值。其表达水平由双ΔCT(ΔΔCT)法进行分析，将GAPDH mRNA的表达作为标准品，用公式2-ΔΔCT来计算。另外采用ELISA试剂盒对上述培养上清液中MMP-2和MMP-9蛋白水平进行测定。

1.3.5Western blot分析 HepG2和MHCC-97L细胞在低温PBS中洗涤2次，然后在RIPA裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂中溶解。细胞裂解物的蛋白质浓度用BCA试剂盒测定，50 μg蛋白通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后转移到PVDF膜上。该膜用吐温-20Tris缓冲盐水(TBST)稀释的5%牛奶室温包被1 h，4 ℃用NF-κB1抗体(1∶1 000)孵育过夜。膜再用辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG二抗孵育(1∶1 000)2 h。将蛋白用ECL试剂显影。密度用的Image J软件进行测定，每个样本的值标准化为GAPDH(1∶1 000)的吸光度值。

1.3.6荧光素酶报告分析 HepG2和MHCC-97L细胞(2×105/孔)于转染前接种于24孔板并培养过夜。细胞用pMIR-EGFR-3′UTR的野生型或突变型质粒、miR-340或miR-NC和pRL-SV40质粒共转染，使用LipofectamineTM2000试剂。在共转染48 h后，萤火虫荧光素和海肾萤光素酶活性用双荧光素酶报告系统定量检测。各组均做3个平行实验。

2 结 果

2.1HepG2和MHCC-97L细胞系中miR-340表达水平比较 qPCR系统检测结果表明，与健康人输卵管上皮细胞株FTE187(1.04±0.08)相比较，在HepG2(0.44±0.05)和MHCC-97L(0.46±0.07)细胞中miR-340表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2miR-340高表达抑制HepG2和MHCC-97L细胞的侵袭能力 侵袭能力通过Transwell侵袭实验进行评价，HepG2和MHCC-97L细胞用miR-340和miR-NC转染，然后在顶室接种。24 h后通过膜侵入的HepG2和MHCC-97L细胞被染色和定量。转染了miR-340的HepG2细胞，通过Transwell小膜浸润的数目(65±8个细胞/高倍视野)比miR-NC组(120±10个细胞/高倍视野)下降54.17%，在MHCC-97L细胞组(41±6个细胞/高倍视野)下降34.17%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 高表达的miR-340抑制HepG2和MHCC-97L细胞的侵袭

2.3miR-340高表达对HCC上皮细胞-间质转化(EMT)相关分子的影响 采用qPCR检测高表达miR-340的HepG2和MHCC-97L细胞中EMT标志物的表达水平。发现高表达miR-340的HepG2细胞和MHCC-97L细胞中E-钙黏蛋白mRNA表达上调，分别为(2.72±0.04)和(2.16±0.03)；N-钙黏蛋白mRNA分别为(0.21±0.01)、(0.34±0.02)表达下调；波形蛋白mRNA分别为(0.31±0.02)、(0.33±0.03)表达下调。而对照组HepG2和MHCC-97L细胞上对应EMT标志物的表达水平分别为E-钙黏蛋白mRNA(1.32±0.02)和(1.12±0.02)；N-钙黏蛋白mRNA分别为(0.61±0.01)、(0.74±0.02)；波形蛋白mRNA分别为(0.52±0.02)、(0.61±0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4HepG2和MHCC-97L细胞中miR-340高表达对MMP-2和MMP-9表达的影响 采用qPCR和ELISA分别检测转染miR-340的HepG2和MHCC-97L细胞中的MMP-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平，结果显示高表达miR-340的HepG2细胞MMP-2的mRNA(0.47±0.04)和蛋白(2.02±0.11)水平降低；MMP-9的mRNA(0.33±0.03)和蛋白(0.87±0.06)水平明显降低，对照组HepG2细胞MMP-2的mRNA(0.67±0.05)和蛋白(3.24±0.18)，MMP-9的mRNA(0.57±0.04)和蛋白(1.56±0.08)，差异有统计学意义(P<0.05)。高表达miR-340的MHCC-97L细胞MMP-2的mRNA(0.19±0.01)和蛋白(1.04±0.08)水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；MMP-9的mRNA(0.27±0.02)和蛋白(1.63±0.07)水平也明显降低，对照组MHCC-97L细胞MMP-2的mRNA(0.37±0.02)和蛋白(2.12±0.10)；MMP-9的mRNA(0.43±0.03)和蛋白(2.32±0.14)，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A表示HepG2细胞中的NF-κB1蛋白质和GAPDH的表达；B表示MHCC-97L细胞中NF-κB1蛋白质和GAPDH的表达

图2miR-340转染的HepG2和MHCC-97L细胞NF-κB1蛋白的表达

2.5TargetScan 6.2软件预测miR-340的作用靶点 TargetScan 6.2软件预测NF-κB1是miR-340的结合物，用Western blot对miR-340转染的HepG2和MHCC-97L细胞中的NF-κB1蛋白质表达进行测定，见图2。结果显示，上调miR-340后，HepG2细胞NF-κB1表达量(1.61±0.13)较miR-NC组(0.96±0.10)降低40%，差异有统计学意义(P<0.05)，MHCC-97L细胞NF-κB1表达量(2.71±0.16)较miR-NC组(0.92±0.11)下降66%，差异有统计学意义(P<0.05)。为了进一步证实NF-κB1是否是miR-340的直接靶点，将NF-κB1的3′-UTR野生型和突变型克隆到荧光素酶指示基因载体，结果显示miR-340显著抑制pMir NF-κB1 3′-UTR WT的荧光素酶活性。

3 讨 论

miRNA是长度为21～23个核苷酸的序列[5]，是调节基因表达的新指标，能够调节细胞增殖、转移、凋亡等参与肿瘤的发生发展[6]。近年来，miR-340被认为是肿瘤抑制基因，在多种生物学过程如细胞迁移和侵袭中发挥作用[7-13]。研究发现其在胃癌、食管癌和乳腺癌中表达降低[14-17]，miR-340在食管癌细胞表达降低，作为抑癌基因通过下调磷酸丝氨酸转氨酶1(PSAT1)抑制食管癌细胞的生长、集落形成和侵袭[10]。高表达的miR-340作用于高迁移率族核小体结合域5(HMGN5)抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭[13]。本研究重点研究了miR-340在人类HCC发病机制中的作用。

本研究通过qPCR技术发现miR-340水平在HCC细胞株HepG2和MHCC-97L比健康人输卵管上皮细胞系FTE187显著降低，换言之，增加miR-340水平可抑制HCC细胞生长发育。这与之前学者报道的miR-340能降低肿瘤的发生率相符[18]。此外，一些报道还证实了miR-340在大肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和口腔鳞状细胞癌也明显下调[9]。这表明miR-340异常可见于多种类型的癌症细胞和组织，因此，推测miR-340降低在肿瘤发生中起着关键作用。

通过Transwell试验发现，miR-340可显著抑制HCC细胞的侵袭。那么，miR-340是如何影响肿瘤细胞侵袭的呢？通过检测miR-340转染的HepG2和MHCC-97L细胞中EMT标志物，EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的过程，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，研究发现，EMT在HCC的迁移侵袭过程中起到关键性的作用[19]，结果表明，miR-340可通过大幅上调上皮标志物E-钙黏蛋白和下调间充质标记物N-钙黏蛋白和波形蛋白从而显著抑制肿瘤细胞的侵袭能力，这个结果表明miR-340可通过抑制EMT来抑制细胞的侵袭能力。

MMP是一类降解细胞外基质的蛋白水解酶，在多种肿瘤细胞的侵袭与转移中发挥关键作用[20]。KAMEL等[21]的研究发现，MMP-2的过表达与卵巢上皮癌的浸润和转移具有相关性。LIU等[22]发现MMP-9的高表达与鼻咽癌淋巴转移和临床分期密切相关，在本研究中，用qRT-PCR和ELISA分别检测转染miR-340细胞的MMP-2与MMP-9的mRNA与蛋白水平。结果显示转染miR-340细胞的MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白水平明显减少，表明上调的miR-340可通过下调MMP-2和MMP-9来抑制细胞的迁移能力。那么推测在miR-340表达降低的HCC细胞中，MMP-2和MMP-9增加了细胞的转移能力。

已有报道称miR-340可通过靶向CDK6，RHCCK1和cMet来影响癌细胞的生长、转移[8-13]。虽然生物信息学工具可能有助于揭示miRNA作用的靶mRNA，但这需要用其他试验来验证。在本文中，显示miR-340的作用靶点是NF-κB1 mRNA，从而揭示了有关肿瘤发生的可能机制。实际上，NF-κB1是Rel/NF-κB转录因子家族的成员，在免疫反应、胚胎和细胞谱系发育和肿瘤发生等都起着关键作用[23]。本研究结果表明，NF-κB1是miR-340的作用靶点。首先，使用免疫印迹确认了miR-340会导致NF-κB1蛋白水平的显著下降。然后发现miR-340的结合区与NF-κB1的mRNA的3′UTR互补。而且，NF-κB13′-UTR萤光素酶活性对miR-340的上调有极强敏感性，miR-340结合位点突变去除了miR-340对萤光素酶活性的调节作用。因此，断定miR-340直接调节NF-κB1表达。

研究者发现MMP-2和MMP-9与NF-κB1发生了同方向改变，但E-钙黏蛋白与NF-κB1却发生了反方向改变。有报道证实了miR-9通过直接靶向NF-κB1表达和下调其下游分子MMP-2和MMP-9来抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移和侵袭[24-26]。另有报道表明miR-9可以通过目标基因NF-κB1抑制E-钙黏蛋白表达来从而抑制黑色素瘤细胞的转移[27]。因此，推测miR-340通过NF-κB1调节MMP-2，MMP-9和E-钙黏蛋白从而抑制肝癌细胞的侵袭和转移。

4 结 论

miR-340在HCC细胞株中表达降低，其作用的靶基因为NF-κB1，上调其表达可以增加E-钙黏蛋白和降低N-钙黏蛋白和波形蛋白从而显著抑制EMT，另外，还可以降低MMP-2和MMP-9从而抑制肝癌细胞转移和侵袭。这种新的miR-340/NF-κB1途径可能对肝癌的潜在分子机制和转移提供新的见解，高表达的miR-340可能为未来预防、诊断和治疗HCC提供新的思路和有效方案，具有潜在临床应用价值。