血管内皮生长因子和微血管密度在食管胃结合部腺癌组织中的表达及临床意义△

闫静波，卫茹，刘登湘，刘晓丽，齐蕾，邱鹏

河北医科大学附属邢台市人民医院1病理科，3放疗科，4肿瘤内科，河北 邢台054031 2邢台医学高等专科学校微生物与免疫教研室，河北 邢台054000

食管胃结合部腺癌（adenocarcinoma of esophagogastric junction，AEG）即食管胃连接线上下5 cm内的腺癌，其预后较差，且发病率逐年上升[1]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种血管形成因子，能增强血管的通透性，促进血管内皮细胞的增殖、侵袭、转移和血管腔样结构的形成，与肿瘤的形成和转移关系密切[2]。微血管密度（microvessel densitv，MVD）是新生微血管的重要指标，CD105表达于组织的新生微血管内皮细胞的细胞膜，较其他抗体（如CD31、CD34）在微血管中的表达更特异[3]。本研究对VEGF蛋白和MVD在AEG中的表达情况及相关性进行分析，并对其与患者临床特征的关系进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2006年6月至2016年6月邢台市人民医院收治的AEG患者。所有患者均未行放、化疗。本研究共纳入AEG患者158例，其中女性57例，男性101例；≥50岁92例，＜50岁66例；肿瘤直径：≥4 cm 74例，＜4 cm 84例；分化程度：中低分化103例，高分化55例；Lauren分型：弥漫型及混合型性67例，肠型91例；浸润深度：肿瘤浸润肌层117例，肿瘤浸润黏膜层41例；有淋巴结转移65例，无淋巴结转移93例；Siewert分型：Ⅰ型8例，Ⅱ型79例，Ⅲ型71例。收集AEG患者的AEG组织和对应的癌旁正常胃黏膜组织（距离肿瘤病灶边缘5 cm的正常胃黏膜）各158例。另外，选取同期于邢台市人民医院行手术治疗的130例上皮内瘤变患者的胃黏膜上皮内瘤变组织，其中低级别上皮内瘤变51例，高级别上皮内瘤变79例。

1.2 免疫组织化学法检测及结果评价

采用免疫组织化学法检测VEGF和MVD表达情况。取AEG组织、癌旁正常胃黏膜组织、低级别和高级别上皮内瘤变组织，常规二甲苯对组织切片进行脱蜡处理，采用梯度乙醇进行脱水，灭活内源性过氧化物酶，滴加山羊血清进行非特异性封闭，37℃孵育15 min。用滤纸吸去封闭液，滴加一抗放入湿盒，4℃孵育过夜；滴加二抗工作液，37℃孵育1 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片进而测定VEGF和MVD在组织中的表达情况。

VEGF蛋白阳性表达定位于细胞质，呈淡黄色、棕黄色或褐色表达。根据着色强度进行评分：0分，无着色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。根据阳性细胞所占比例进行评分：＜10%为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。着色强度与阳性细胞所占比例得分乘积≥2分为阳性，0～1分为阴性。所有标本均经1位病理副主任医师诊断和1位病理主任医师审核。

MVD阳性表达定位于血管内皮细胞膜，呈棕褐色表达。MVD计算方法参照Weidner计数法[4]：阳性表达的单个内皮细胞或内皮细胞簇均计数为1个微血管，管腔直径大于8个红细胞、带静脉窦及较厚肌层的血管不计入微血管；先在100倍光镜下扫视整个组织切片，选取5个微血管密度最高的区域，然后在400倍光镜下计数5个区域着色的微血管数，取其平均值表示MVD值。

1.3 蛋白质印迹法（Westernblot）检测蛋白表达情况

裂解液提取AEG组织、癌旁正常胃黏膜组织、低级别和高级别上皮内瘤变组织中的总蛋白，参照标准裂解蛋白曲线测定蛋白的相对表达量。取4组变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，把凝胶电泳内的蛋白转移到硝酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭1 h。加入VEGF抗体4℃过夜，加入二抗工作液，室温下摇床中孵育2 h后，加入碱性磷酸酶显色剂20 min。扫描仪扫描条带的灰度，自动图像分析系统进行定量分析，以癌旁正常胃黏膜组织蛋白的光密度值为参考标准1，AEG组织、低级别上皮内瘤变组织和高级别上皮内瘤变组织中目的蛋白与癌旁正常胃黏膜组织蛋白光密度值的比值作为各蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验；用Spearman法分析AEG患者组织中VEGF与MVD的相关性。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF阳性表达率和MVD值的比较

癌旁正常胃黏膜组织、低级别上皮内瘤变组织、高级别上皮内瘤变组织和AEG组织中VEGF阳性表达率和MVD水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。两两比较结果显示，癌旁正常胃黏膜组织中VEGF阳性表达率和MVD水平均低于低级别上皮内瘤变组织、高级别上皮内瘤变组织和AEG组织；AEG组织中VEGF阳性表达率和MVD水平均高于低级别上皮内瘤变组织和高级别上皮内瘤变组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组织中VEGF阳性表达情况及MVD值的比较

2.2 VEGF蛋白相对表达量的比较

癌旁正常胃黏膜组织、低级别上皮内瘤变组织、高级别上皮内瘤变组织和AEG组织中VEGF蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较结果显示，癌旁正常胃黏膜组织中VEGF蛋白的相对表达量低于低级别上皮内瘤变组织、高级别上皮内瘤变组织和AEG组织，AEG组织中VEGF蛋白的相对表达量高于低级别上皮内瘤变组织和高级别上皮内瘤变组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同组织中VEGF蛋白相对表达量的比较（±s）

表2 不同组织中VEGF蛋白相对表达量的比较（±s）

注：a与癌旁正常胃黏膜组织比较，P＜0.05；b与低级别上皮内瘤变组织比较，P＜0.05；c与高级别上皮内瘤变组织比较，P＜0.05

组织类型VEGF蛋白癌旁正常胃黏膜组织（n=158）低级别上皮内瘤变组织（n=51）高级别上皮内瘤变组织（n=79）AEG组织（n=158）F值P值1.00±0.15 3.82±0.58a 6.01±0.97a b 8.26±1.30a b c 1779.76＜0.01

2.3 AEG组织中VEGF表达情况、MVD值与AEG患者临床特征的关系

中低分化、弥散型及混合型、浸润肌层和有淋巴结转移AEG患者的AEG组织中VEGF阳性表达率分别高于高分化、肠型、浸润黏膜层和无淋巴转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=7.013、5.721、6.330、5.971，P＜0.05）；中低分化、弥漫型及混合型、浸润肌层和有淋巴转移AEG患者的AEG组织中VEGF蛋白相对表达量分别高于高分化、肠型、浸润黏膜层和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（t=6.783、5.692、5.210、4.702，P＜0.05）；中低分化、浸润肌层和有淋巴转移AEG患者的AEG组织中MVD分别高于高分化、浸润黏膜层和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（t=5.470、6.271、3.562，P＜0.05）。（表3）

2.4 AEG组织中VEGF与MVD的相关性分析

158例AEG患者的AEG组织中，VEGF表达阴性的MVD为（23.83±12.26），低于VEGF表达阳性的 MVD（51.17±16.76），差异有统计学意义（t=0.815，P＜0.05）；AEG组织中VEGF的表达水平与MVD值呈正相关（r=0.491，P＜0.05）。

表3 不同临床特征AEG患者的AEG组织中VEGF表达情况及MVD值

3 讨论

食管胃交界部（esophagogastric junction，EGJ）指下段食管和贲门、上段胃连接处的解剖学部位。发生在EGJ的恶性肿瘤称为食管胃结合部肿瘤，包括AEG及远端食管鳞状细胞癌[1]。AEG指肿瘤中心位于EGJ上下5 cm范围内的腺癌，常用Siewert分型，分为3型：AEG SiewertⅠ型，通常发生于下段食管黏膜的腺癌，起源于Barrett食管，肿瘤中心位于EGJ上方1～5 cm的腺癌，能够从上方向下方浸润EGJ；AEG SiewertⅡ型，发生于EGJ或者贲门的黏膜肠化区，肿瘤位于EGJ上方1 cm至EGJ下方2 cm；AEG SiewertⅢ型肿瘤是位于EGJ下方2～5 cm的腺癌，可以从下方向上方浸润EGJ或下段食管[1]。欧美国家Siewert 3种分型AEG发病率基本相同；亚洲国家AEG SiewertⅠ型发病率相对较低，AEG SiewertⅡ型和Ⅲ型发病率相对较高[5]。已有研究发现，胃窦癌在全球发病率下降，然而AEG发病率逐年上升且AEG预后差，5年生存率为8%～37%[6]。

肿瘤的侵袭和转移离不开新生微血管，新生微血管为肿瘤提供氧和营养，使肿瘤细胞进行代谢和增殖。新生微血管形成前，肿瘤缺乏营养和供氧，肿瘤灶较小，也无临床症状；新生微血管形成后，肿瘤快速生长，转移能力增强[7]。MVD作为衡量新生微血管的重要参数，与肿瘤的发生发展密切相关，当MVD值增加时，肿瘤细胞易穿透血管壁，迁入血液进行转移[8-10]。因此，在肿瘤的生长和转移中，MVD是独立的临床预后指标[10]。

VEGF是作用最强的血管生成因子，能促进微血管新生[2]。本研究结果显示，AEG组织中VEGF与MVD的表达呈正相关（P＜0.05）。VEGF广泛分布于各种组织的血管内皮中，促进血管内皮细胞的增殖，增加微血管的通透性和营养外渗，使肿瘤获得更多的营养和供氧而加快生长，同时也增加了肿瘤细胞向循环系统侵袭的可能性；VEGF与内皮细胞上的受体结合后，也促进肿瘤生长，脱落的肿瘤细胞进入血管，加快肿瘤转移[9]。本研究结果显示，癌旁正常胃黏膜组织中VEGF阳性表达率及蛋白相对表达量和MVD值均最低，AEG组织中VEGF阳性表达率及蛋白相对表达量和MVD值均最高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。因而，VEGF和MVD表达在肿瘤的血管生成和转移中发挥重要的作用，寻找以VEGF和MVD为靶点的药物将对肿瘤的治疗提供新的方法，并具有现实意义。

不同临床特征AEG患者的AEG组织中VEGF表达情况及MVD值的比较，中低分化、弥散型及混合型、浸润肌层和有淋巴结转移AEG患者的AEG组织中VEGF表达情况分别高于高分化、肠型、浸润黏膜层和无淋巴转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中低分化、浸润肌层和有淋巴转移AEG患者的AEG组织中MVD分别高于高分化、浸润黏膜层和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明AEG组织中VEGF和MVD值表达升高，同时促使肿瘤进行性生长，使肿瘤分化程度低，恶性程度增高。

综上所述，VEGF及MVD表达与AEG发生发展密切相关，深入研究VEGF及MVD在AEG中的表达及其机制，可为治疗AEG寻找新的有效方法。