HPLC法测定截短侧耳素发酵液含量方法探讨

库丽扎达·木拉提

（新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐 830063）

兽药在保证动物源性食品供应方面发挥着巨大作用。随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性问题变得日益严重，多药耐药菌感染已成为威胁人类健康的重要问题，截短侧耳素类是具有较好抗菌活性的抗生素家族，对大部分革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌有良好的抑菌效果。截短侧耳素发酵液具有毒性较低，对环境影响小等特点。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪：Agilent1260(美国Agilent公司)；十万分之一天平（Mettler xs105）；5 mL一次性注射器。

1.2 试剂和试药

甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司），乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司），水（超纯水），高氯酸（分析纯，北京北化精细化学品有限公司），碳酸铵（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；截短侧耳素标准品(批号为20170314，含量为99.7%,中国兽医药品监察所)，截短侧耳素发酵液（发酵放罐样品）。

1.3 溶液的制备

1.3.1 高氯酸溶液（6%）

量取400 mL超纯水置于500 mL容量瓶中，再用刻度吸管移取41.7 mL高氯酸（分析纯）置于该容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀。

1.3.2 碳酸铵缓冲溶液（1%）

精确称量10 g碳酸铵（分析纯）置于1 000 mL容量瓶中，加入800 mL超纯水溶解，用刻度吸管移取6%高氯酸溶液24 mL加入其中，再用超纯水稀释至刻度混匀，过滤，待用。

1.3.3 流动相溶液

按照碳酸铵缓冲溶液（1%）：色谱级乙腈：色谱级甲醇28：23：49的比例混合均匀，再用0.45 μm的过滤膜过滤，滤液置于所配体积的容量瓶中，超声15 min脱气，备用。

1.4 标准品溶液

精确称量截短侧耳素工作标准品适量（约0.1 g）（精确至0.0001 g）于50 mL容量瓶中，用流动相溶解，超声15 min，使之充分溶解，冷却，定容，配成浓度为2 mg/mL的溶液，待用。

1.5 样品溶液的制备

根据发酵周期，预估含量称重，放入50 mL容量瓶中，加入流动相30 mL左右溶解，振荡超声15 min，冷却至室温，用流动相定容至50 mL，用微孔滤膜过滤器过滤。

式中：m1—标准品重量（g）； a—标准品含量（μg）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm,流动相为碳酸铵缓冲溶液（1%）：色谱级乙腈：色谱级甲醇 28：23：49的比例混合均匀，再用0.45 μm的过滤膜过滤，滤液置于所配体积的容量瓶中，超声15 min脱气，备用，流速为1.2 mL/min，检测波长为212 nm，柱温为30±3℃，进样量20 μL。

2.2 检测方法

首先进标准品溶液两针（1.4），记录相关峰面积，再进样品溶液两针（1.5），记录相关峰面积，计算截短侧耳素发酵液含量（发酵350 h以上的效价，应≥10 000 μg/g）。计算公式为

式中：S1—待测溶液色谱图峰面积；S0—标准品溶液色谱图峰面积；m0—标准品重量 （g）；m1—待测溶液重量（g）；A—标准品的含量（%）。 (结果见图1、图 2)

图1 截短侧耳素标准品色谱图

图2 截短侧耳素发酵液样品色谱图

2.3 检测结果

含量测定结果，见表1。

表1 含量测定结果表

2.4 精密度试验

取1.5项下截短侧耳素样品20 μL，按2.1项下色谱条件重复进6次，记录色谱图峰面积，结果见表2，截短侧耳素峰面积的RSD为0.13%，表明色谱系统精密度良好。

表2 精密度试验表

2.5 重复性试验

取按1.5项制备的6份供试品，按2.1色谱条件分析，记录色谱图，计算含量，平均值为17 973.7 μg/mL，RSD为0.1%，表明该方法中截短侧耳素的重复性良好，结果见表3。

表3 重复性试验表

3 讨论

用该方法测定截短侧耳素发酵液含量，同一样品平行测定6次，平均含量值为17976.6 μg/g，峰面积的RSD为0.13%；经测定6个样品含量平均值为17 973.7 μg/g；RSD为0.10%；截短侧耳素发酵液经过精密度试验、重复性试验测定结果RSD均在规定的范围内，灵敏度高，前处理简便，样品较稳定，符合规定。

用HPLC法测定截短侧耳素发酵液含量，适用范围广，方法合理、操作便捷，大大缩短检验时间。适合于截短侧耳素发酵液的检测，并控制该产品的质量，可作为截短侧耳素发酵液的质量标准，用于截短侧耳素的含量测定，以控制、保证产品质量。