不同毛色中国美利奴羊毛纤维细度与黑色素含量分析

余 刚 ，司小花，沈思军 ，郭延华 ，张 宾，代 蓉 *

（1.新疆兵团第十师181团农业发展服务中心，新疆 北屯 836001；2.新疆西部牧业股份有限公司，新疆 石河子 832000;3.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；4.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 832000）

羊毛中黑色素的含量和种类决定了羊毛的颜色，但对羊毛颜色的评定还是由主观的肉眼观测为主，影响羊毛颜色的因素有很多，如品种、性别、气候、营养条件等，但黑色素的含量和种类是决定羊毛颜色的核心因素。动植物的颜色形成机制不同。植物的颜色主要是类胡萝卜素和花青素共同作用呈现出五彩缤纷的颜色，昆虫[1]和鸟类羽毛的颜色是由色素和羽毛结构共同作用的结果[2,3]。对于哺乳动物而言，皮肤和毛发的颜色主要是由细胞内黑色素的含量和种类不同决定的，其中酪氨酸来源的色素（黑色素及其衍生物）是决定毛色的主要原因[4]。

黑色素是黑色素细胞产生的一种不溶于水和大多数有机溶剂的无定形蛋白质衍生物[5]，广泛存在于高等动物的皮肤、粘膜、视网膜、软脑膜、胆囊及卵巢处。黑色素包括真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(pheomelanin,PM)，二者的相对数量与分布决定了哺乳动物毛皮颜色由浅至深的多种表型。褐黑素为溶于碱的圆形红色颗粒，能使皮肤或毛发表现为黄色和红色；真黑素比褐黑素难溶，可使皮肤或毛发表现为褐色和黑色。Forrest等[6]鉴定出美利奴[3]羊皮肤中的黑色素细胞主要分布在皮肤的表皮-真皮边界、外毛根鞘和毛球部，而毛球部是毛干黑色素产生的唯一部位。为明确毛发、皮肤及其他组织器官中黑色素的种类和含量[4]，研究人员尝试了多种方法。与光谱法、高效液相色谱法（HPLC）等技术相比，化学分光光度法需要的设备价格低廉，操作简便，可广泛用于生产实践。

在羊毛颜色形成的研究中，对羊毛颜色的鉴定多以肉眼观测为主，缺少一个客观科学的评定方法。范文瑞等利用乌贼黑比色法检测了毛色不同的羊驼毛纤维中黑色素种类和含量，本研究借鉴了检测羊驼毛纤维黑色素的方法，分析黑色素的含量和种类与羊毛纤维颜色间的关系，建立稳定的中国美利奴羊毛纤维黑色素定量和定性检测的方法，降低肉眼观察毛色的产生的主观影响，建立毛色表型的科学评定方法，同时也为深入分析有色毛形成的内在机制提供研究基础。

1 材料与方法

选择不同毛色（白色3只，灰色3只，棕黑色7只）的中国美利奴[5]羊（军垦型）（图1），所有羊只都来源于新疆农垦科学院试验羊场，饲喂和管理条件相同。取肩胛部羊毛[6]样品50 g，用于测定羊毛纤维直径和羊毛黑色素含量。

图1 不同毛色羊毛样品

1.1 羊毛纤维细度检测分析[7]

采集待测个体肩胛部毛样[8]，无水乙醇漂洗2～3次，晾干；取适量洗净羊毛样品安装固定在羊毛切片器上，取靠近皮肤的毛切片；切下的毛样置于载玻片上，滴1～2滴石蜡油；轻微搅拌，使毛样散开；盖上盖玻片，置于CU-4羊毛纤维细度分析仪选择非冻干参数模式测量羊毛纤维细度，检测数量≥300根。

1.2 羊毛黑色素含量及种类检测分析[9]

采集的羊毛清洗晾干后备用。参考[7,8]乌贼黑比色法利用分光光度计检测毛样中碱性可溶性黑色素（ASM）、真黑色素（EM）和褐黑素的含量（PM）。

碱性可溶性黑色素含量：30 mg毛样剪成小段置于5 mL离心管中，加3 mL 1M NaOH，85℃反应4 h；取3 mg乌贼黑催粉剂于3 mL双蒸水中，37℃超声处理5 min，降解成更小的可溶性颗粒；400 nm以乌贼黑溶液调零分光光度仪；以3 mL 1M NaOH作为参比液，将分光光度仪调至100；400 nm下检测乌贼黑和所有样品的OD值。

10 mg毛样中碱性可溶性黑色素含量=（乌贼黑含量/ml×样品OD值）/乌贼黑OD值

真黑素含量：30 mg毛样剪成小段置于5 mL离心管中，加3 mL 30%氢碘酸80℃反应2 h；冷却后加入3 mL50% 乙醇，2 234 g离心10 min，取沉淀；向沉淀中加入1M NaOH，80℃反应4 h，10 000 g离心10 min取上清350 nm下测样品上清液和乌贼黑溶液的OD值。

10 mg毛样中真黑素含量=（乌贼黑1mg/mL×样品OD值）/乌贼黑OD值

褐黑素含量：30 mg毛样剪成小段置于15 mL离心管中，加3 mL 0.1M PBS(pH10.5)；室温剧烈混合后10 min,10 000 g离心10 min取上清，向上清液中加2 mL氯仿，振荡均匀，4 000 r/min 10 min取黄色上清液；10 000 r/min 10 min取上清液；400 nm下检测样品和乌贼黑OD值。

10 mg毛羊中褐黑素含量=（乌贼黑1 mg/mL×样品OD值）/乌贼黑OD值

1.3 数据统计方法

对羊毛纤维中总黑色素、真黑色素和褐黑色素的含量用单因素方差分析检测不同毛色之间的差异。用Pearson相关分析不同黑色素间的相关性[10]。

2 结果与分析

2.1 不同毛色中国美利奴（军垦型）羊毛纤维的细度

不同毛色中国美利奴羊（军垦型）肩胛部羊毛纤维直径检测结果如表1所示。从表中可以看出白色、灰色和棕黑色3组羊毛样品中，羊毛纤维细度在18～20 μm之间。单因素ANOVA统计分析结果显示，不同毛色中国美利奴羊羊毛细度无显著差异[11]（＞0.05）。

表1 不同毛色中国美利奴（军垦型）羊毛细度

采用Pearson相关分析羊毛细度与毛色之间的关系（表2）。从表中可以看出，毛色与细度之间的相关系数为0.108（＞0.05），表明羊毛细度与羊毛颜色之间无显著相关关系。本研究中所选择的非白色羊毛个体均来自于中国美利奴羊（军垦型）群体，羊毛细度检测结果证明不同毛色个体的羊毛细度无差异，与样本来源相符。

表2 羊毛细度与毛色Pearson相关性分析

2.2 不同毛色中国美利奴（军垦型）羊毛纤维中黑色素的含量

本试验中利用乌贼墨比色法分析了不同毛色中国美利奴（军垦型）羊毛纤维黑色素的种类和含量（图2）。对不同毛色分组比较羊毛中黑色素种类和含量检测数据进行单因素ANOVA统计分析（表3）。结果显示，ASM含量在不同组中的含量变化较大，白色羊毛中含量最少，黑色羊毛中的含量最多，组间存在极显著的差异（＜0.01）。毛纤维中EM和PM变化趋势与ASM相同且含量极显著少于ASM（＜0.01），但不同毛色组间差异不显著（＞0.05）。EM在羊毛中的含量也随着羊毛颜色变深而增加，但各组间含量变化也未达到显著水平（＞0.05）。PM在不同毛色的羊毛样本中的含量很低，但白色个体中的变化水平相对稳定且含量低于有色个体，棕黑色羊毛中PM含量是白色组的两倍多（P＞0.05）。白色组中EM与PM总量占ASM含量的28.7%，在灰色和棕黑色组中的比例约为18%，EM和PM在ASM中的百分比值与羊毛颜色变化相反。

图2 羊毛黑色素含量分析

表3 不同毛色中国美利奴（军垦型）羊毛纤维黑色素含量[13]

采用Pearson相关分析羊毛颜色与黑色素种类和含量之间的关系 （表4）。结果显示，羊毛纤维中ASM、EM和PM含量与毛色的深浅变化相一致，随着毛色变深ASM、EM和PM含量呈现增加的趋势，它们的含量变化与羊毛毛色之间呈现显著的正相关关系[14]（表4）。其中ASM与毛色之间表现为极显著的高度正相关（相关系数0.962，＜0.01），EM和PM含量与毛色表型间均表现为极显著的强正相关（相关系数0.570,0.585，＜0.01）。EM和PM占ASM中的百分比与羊毛颜色表现为显著的强负相关 （相关系数-0.547）。

表4 羊毛毛色与黑色素种类和含量的Pearson相关性分析

3 讨论

羊毛中黑色素是由毛球中的黑色素细胞合成的。黑色素的合成过程中受到不同基因的调节最终形成真黑素和褐黑素，黑色素的含量及真/褐两种黑色素的比例决定了羊毛的颜色，其中真黑素产生黑色至褐色的毛发，而褐黑素则对应黄色至红色的毛发。科学工作者研发了多种方法检测皮肤和毛发中的黑色素。如拉曼光谱分析、皮肤反射光谱、电子自旋共振(ESR)光谱、化学裂解比色法和HPLC法等。化学裂解比色法和HPLC法均需要强碱处理样品，无法在动物活体直接进行分析；其他几种方法虽然可以实现无创伤的检测但所需的仪器设备昂贵，而化学裂解比色法所需要仪器简单，操作简便，可被广泛应用于生产实践中[15]。

利用HPLC和化学裂解比色法研究哺乳动物毛发中黑色素的含量和种类已有成功的应用，大量的研究结果提示出哺乳动物毛色与毛纤维中黑色素的含量和种类有着密切的关系。如Aliev等[9]利用HPLC法检测了羊毛中的黑色素类型及含量，无论是显性黑还是隐性黑毛表型都与真黑素含量相关，而从棕到红的表型则是由两种黑色素的比例变化导致的。范瑞文等[7]利用乌贼黑比色法检测了不同毛色驼毛纤维中黑色素的含量和种类。本研究以在中国美利奴育种群中发现的有色个体为研究对象，利用乌贼黑分光光度计比色法[7,8]分析了不同毛色羊毛样本中黑色素含量和种类，证明羊毛纤维中黑色素的含量是影响羊毛颜色的决定因素。

与其他研究结果相似，不同颜色的中国美利奴羊毛纤维中褐黑素的含量极显著地低于真黑素和碱性可溶性黑色素，有色中国美利奴羊毛表型以棕黑色为主，而褐黑素主要产生黄色至红色的毛发，因此低浓度的褐黑素也与羊毛颜色相一致。Toth等[10]在研究马毛色与黑色素含量间的关系发现，黑色素含量与马灰毛表现出强烈的负线性关系（＜0.01），本试验中发现在白色中国美利奴羊毛纤维中真黑素与褐黑素之和占碱性可溶性黑色素的比例高于棕黑色和灰色羊毛，但黑色素总量极显著低于灰色和棕黑色组；灰色和棕黑色羊毛中真黑素与褐黑素总量占碱性可溶性黑色素的比例数相近，都表明碱性可溶性黑色素总量的多少决定了羊毛白与非白表型，而真黑素和褐黑素的含量则决定白色与非白羊毛纤维的颜色变化。

4 结论

本研究建立了基于乌贼黑比色法检测中国美利奴羊毛纤维中黑色素含量和种类的方法，检测了不同毛色中国美利奴（军垦型）羊毛纤维细度及羊毛中黑色素的含量和种类，结果表明羊毛色变化与羊毛细度之间无相关性，羊毛黑色素含量和种类与羊毛纤维颜色有显著的相关关系。随着羊毛颜色的变深，羊毛纤维中三种黑色素含量增加。在非白色羊毛真黑素与褐黑素在ASM中的比例相对稳定，白色羊毛中二者占ASM的比例高于非白色羊毛。研究结果提示黑色素对羊毛颜色的形成是一个比较复杂的过程，羊毛纤维中ASM含量与羊毛颜色的深浅有关，真黑素和褐黑素在羊毛黑色素中的比例则可能与羊毛的白色与非白色表型相关。