基于芴母核的新型水溶性弱酸性荧光pH指示剂

2019-10-17李华锟廖永芳刘阳平

天津医科大学学报 2019年5期

李华锟，廖永芳，刘阳平

（天津医科大学药学院药物化学教研室，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070）

细胞内pH的动态变化被认为是理解细胞中许多生理功能调节机制的关键[1]。pH值的有效控制对维持细胞正常的生理活动十分重要。目前细胞内pH值测定方法主要有光化学法、弱酸弱碱分布法、微电极法、核磁共振法等几种。其中光学方法有响应时间快，高信噪比，无创性和良好的pH敏感性等几个优点。自从首次捕获到细胞内的pH探测器6-羧基荧光素后，Thomas等[2-3]已经描述了很多pH指标性质[1,4-11]。

为了定量的测量pH值，需要指示剂的pKa与实验系统的pH值相匹配。溶酶体与内涵体是存在于细胞结构中的亚细胞结构，在细胞的活动中扮演着重要的作用，所以对于这些细胞器的定位与追踪，具有重要的意义。由于溶酶体和内涵体的pH值分别在4～5和5～6之间，因此开发高效的弱酸性pH荧光指示剂是非常有意义的。在此，笔者报告一种基于新型芴衍生物的敏感的弱酸性荧光pH指示剂。

芴衍生物以其高荧光量子产率和优异的光稳定性著称[12-13]。最近芴基共轭化合物因为其中具有高双光子吸收（2PA）横截面，也被报道为优异的双光子荧光（2PF）材料[14-18]。因此本文基于芴母核进行衍生化以期得到可以指示弱酸性pH的荧光探针。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器二乙二醇-2-溴乙基甲醚、2,7-二溴芴、正丁基锂（n-BuLi）、碘化钾（KI）、二乙胺和2-氨基苯硫酚等试剂购买于阿拉丁试剂公司。干燥的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）购买于Sigma试剂公司。干燥的THF经过金属钠干燥处理制备。核磁数据采集于Bruker 400M核磁共振波谱仪上。

1.2 目标化合物的合成路线及合成步骤见图1。

1.2.1 化合物9,9-二乙二醇甲醚乙基-2,7-二溴芴2的合成将2,7-二溴芴（0.907 g,2.8 mmol）、二乙二醇-2-溴乙基甲醚（1.294 g,5.7 mmol）溶于DMSO（7 mL）中，当然后加入 KI（0.049 g，0.3 mmol）和KOH（0.665 g，11.9 mmol），在氩气保护下室温搅拌1 h。将反应液倒入水中（50 mL），乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），有机相水洗，无水 Na2SO4干燥，减压浓缩。浓缩液经硅胶柱层析纯化（PE:EA=10:1）得黄色化合物 2（1.328 g），产率 77%。

图1 目标化合物5的合成路线Fig 1 The synthetic route of target compound 5

1.2.2 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-溴芴-2-甲醛3的合成将原料2，7-二溴芴（1.18 g，1.914 mmol）溶于干燥的 THF（7 mL）中，冷却至-78 ℃，然后缓慢滴加n-BuLi（1.6 mol/L正己烷溶液，1.28 mL）。滴加完毕后 20 min，加入 DMF（0.21 mL，2.693 mmol）与 THF(0.37 mL)的混合溶液，反应液在此温度下反应1.5 h，然后缓慢升至室温反应1 h。反应液冷却至5℃，加入盐酸水溶液（2 mol/L，1.5 mL）淬灭反应。反应液用乙酸乙酯萃取3次（40 mL×3），合并有机相并用饱和NaHCO3洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩得粗产品，经硅胶柱层析纯化（PE:EA=8:1）得白色目标化合物（0.806 g），产率78.4%。

1.2.3 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-二乙胺基芴-2-甲醛4的合成将化合物3（0.679 g，1.2 mmol）溶于干燥的DMF（4 mL），然后加入二乙胺（0.877 g，12 mmol），氩气保护油浴加热回流反应12 h。反应结束，将反应液倒入水中（50 mL），乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），1N 盐酸水溶液洗涤（20 mL），水洗（20 mL），无水NaSO4干燥，减压浓缩。浓缩液经硅胶柱层析纯化得化合物4（0.468 g），产率70%。

1.2.4 化合物9，9-二乙二醇甲醚乙基-7-二乙胺基-2-（2-苯并噻唑）芴的合成将化合物4（0.329，0.59 mmol）和 2-氨基苯硫酚（0.18 g，1.48 mmol）溶于DMSO（3 mL），油浴加热195℃反应 2.5 h。反应结束将反应液倒入水（30 mL）中，乙酸乙酯萃取3次（20 mL×3），饱和 NaHCO3洗涤，水洗，无水 Na2SO4干燥，减压浓缩。浓缩液经硅胶柱层析纯化（PE:EA=5:1）的黄色目标化合物（0.265 g），产率68%。

2 结果

2.1 目标化合物和中间体核磁数据的表征在碱性条件下对2,7-二溴芴的9位进行双烷基取代得到化合物2，然后n-Buli拔溴与DMF反应得到化合物3，随后再与二乙胺发生亲核取代发应得到化合物4，化合物4与2-氨基苯硫酚缩合得到目标化合物5。并对各中间体和目标化合物进行核磁表征，数据如下：

化合物 2：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ7.53-7.45（m，6H），3.54-3.52 （m，4H），3.50-3.47（m，4H），3.40-3.38（m.4H），3.34（s，6H），3.22-3.19（m，4H），2.77（t，J=7.6 Hz，4H），2.33（m，7.6 Hz，4H）（图 2）。

化合物 3：1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ10.05（s,1 H）,7.92（s,1H)，7.88（dd，J=7.6，1.2 Hz，1H），7.79（d，J=8.0 Hz,1H），7.62（d，J=8.4 Hz，1H），7.63（d，J=2.4 Hz，1H），7.51（dd，J=8.0，1.6 Hz，1H），3.51-3.44（m，8H），3.36-3.33（m，10H），3.18-3.16（m，4H），2.79-2.75（m，4H），2.47-2.34（m，4H）（图 3）。

图2 化合物2核磁表征Fig 2 MNR Characterization of Compound 2

图3 化合物3核磁表征Fig 3 MNR Characterization of Compound 3

化合物 4：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ9.96（s，1 H），7.83 （s，1H），7.78 （d，J=7.2 Hz，1H），7.60-7.51（m，2H），7.68-6.57（m，2H），3.51-3.18（m.26H），2.84-2.72（m，4H），2.45-2.26（m，4H），1.21（t，J=7.2 Hz，6H）（图 4）。

化合物 5：1H NMR （400 MHz，MeOD）δ8.15（s，1H），8.01-7.98（m，3H），7.65-7.39（m，4H），6.80（s，1H），6.75（d，J=6.4 Hz，1H），3.49-3.18（m，26H），2.93-2.80（m，4H），2.51-2.34（m，4H），1.28-1.21（m，6H）（图 5）。

图4 化合物4核磁表征Fig 4 MNR Characterization of Compound 4

图5 化合物5核磁表征Fig 5 MNR Characterization of Compound 5

2.2 化合物5紫外吸收变化与pH值的关系质子化的化合物5的最大吸收峰在341 nm，中性态化合物5的最大吸收峰在409 nm。紫外吸收光谱随pH值的变化如图6所示，随着pH值的增加，化合物在341 nm的吸收强度逐渐降低，而409 nm的吸收强度逐渐升高，并在355 nm处形成一个等当点。由于与芴相连的二乙胺基氮的碱性明显高于苯并噻唑氮的碱性，因此质子化优先发生在二乙胺基氮的位置。根据文献报道的方法，对341 nm处的紫外吸光度进行非线性回归，结果显示化合物5的pKa为5.75±0.12。

图6 在磷酸缓冲液中（50 mmol/L），化合物5（25 μmol/L）的吸收光谱显示为pH依赖性，箭头显示吸收强度随pH增加而变化。（箭头）341 nm处吸光系数与pH值非线性拟合Fig 6 pH dependence of the absorption spectra of compound 5(25 μmol/L)inPB buffer(50 mmol/L)with arrow indicating thechange of the absorption intensities with pH increase.(Arrow)Nonlinearfittingof the pH-dependent extinctioncoefficientsat341nm

图7 在355 nm（吸收等当点波长）处激发，化合物5（10 μmol/L）在磷酸缓冲液(50 mmol/L)中荧光强度显示pH依赖性，箭头显示荧光强度随pH增加而变化。（箭头）391nm处荧光强度与pH值的非线性拟合Fig 7 pH-dependence of the fluorescence intensity of compound 5(10 μmol/L)in PB buffer(50 mmol/L)excited at 355 nm(absorption isobestic point wavelength in Fig 1)with arrow indicating the change of the fluorescent intensities with pH increase.(Arrow)Nonlinear fitting of the pH-dependent fluorescent intensity at 391 nm

2.3 目标化合物荧光强度变化与pH值的关系由图7所示，当化合物5在等当点（355nm）波长处被激发时，可以观察到质子态和中性态的荧光发射，分别在392 nm和571 nm。随着pH值的增加，392 nm处的荧光强度逐渐降低，571 nm处的荧光强度逐渐增加。根据文献报道的方法，对392 nm处的荧光强度进行非线性回归，结果显示化合物5的pKa为5.88±0.06。这一结果与利用341 nm处的紫外吸光度进行非线性回归所得pKa相吻合。