FSTL1促进间歇性低氧诱导的肺成纤维细胞活化

徐雷倩，曹 洁

（天津医科大学总医院呼吸科，天津300052）

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）是以睡眠过程中频繁的呼吸暂停、血氧饱和度下降和睡眠紊乱为主要特征的临床综合征[1]。OSAS对机体的危害是多系统的，除了呼吸系统外，还包括心脑血管、神经系统、泌尿系统以及内分泌系统等，严重者易出现夜间猝死的情况，这些并发症与OSAS的间歇性低氧密切相关。OSAS与呼吸系统疾病密不可分，临床上将两者共患称为重叠综合征。肺心病是其中最为突出的一个疾病，患者往往有严重的肺动脉高压和右心衰竭[2]。由于呼吸功能障碍，夜间长时间的呼吸暂停，使得急性呼吸衰竭的发生率升高，出现严重呼吸困难、发绀、抽搐等表现[3]。另外肺纤维化的发生发展也与OSAS相关，可能原因是间歇性低氧对肺成纤维细胞的活化作用。对于阻塞性睡眠呼吸暂停的治疗以呼吸机治疗为主，用于扩张气道，减少夜间呼吸事件的发生，防止过低的通气导致的夜间猝死和并发症[4]。氧化应激在OSAS进程中具有十分重要的作用，它能与TGF-b、NF-kb、AMPK等多种信号通路相互联系，共同促进疾病的发生发展。Fstl1最初是从TGF-b1诱导的小鼠成骨细胞系MC3T3中克隆得到，其编码一个胞外分泌的小分子糖蛋白。最近的研究发现FSTL1在特发性肺纤维化以及矽肺等纤维化疾病中是一个新的促纤维化因子。Fstl1能够通过增强TGF-b信号而促进肺成纤维细胞的活化，以及胶原和纤连蛋白等细胞外基质（ECM）的沉积，最终加剧肺纤维化的发展。利用Fstl1基因敲除小鼠或者FSTL1蛋白的中和性抗体阻断体内FSTL1的生物学功能则能够减缓肺纤维化的严重程度[5]，说明Fstl1可能是纤维化肺疾病的一个重要靶点。目前，Fstl1与OSAS以及其并发症是否相关并没有相关研究。睡眠呼吸暂停的突出特征是夜间锯齿样的血氧波动，而间歇性低氧成为OSAS体外细胞模型的主要控制因素[6]，OSAS所造成的间歇低氧可导致氧化应激反应，而肺纤维化的发生发展和肺成纤维细胞的的活化也离不开氧化应激的作用[7]，所以OSAS的间歇低氧可能会引起肺成纤维细胞的活化，包括细胞外基质的沉积和氧化应激产物的表达[8]，而这种活化又与FSTL1相关。本研究主要探讨OSAS模式下的间歇低氧（IH）引起的氧化应激反应与FSTL1蛋白之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠原代肺成纤维细胞，胎牛血清（FBS），DMEM培养基，胰蛋白酶（美国Gibco公司），抗氧化剂Temple（Sigma公司），CAT试剂盒（南京建成公司），MDA试剂盒(南京建成公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10% FBS的DMEM培养基对小鼠原代肺成纤维细胞进行培养，并放在湿度合适、温度37℃、5% CO2的培养箱内。直至细胞在培养皿内生长到80%～90%且细胞状态良好，移除皿内培养基，用PBS小心清洗2遍，再加入1 mL的0.25%的胰蛋白酶消化，加入适量培养基，混匀吹打后，按2mL/孔的细胞量接种于P60细胞培养皿内，至成纤维细胞长到80%～90%，PBS冲洗，转移至撤去血清的培养基。

1.2.2 间歇低氧处理细胞 把分好盘的小鼠肺成纤维细胞放置于间歇低氧实验设备内，通过电路板和计算机程序（天津医科大学总医院呼吸科呼吸仿真系统）控制低氧/再氧合的循环（包括循环次数和循环时间）。间歇低氧的频率为：低氧90s，复氧120s，用测氧仪调整低氧时实验设备内的氧浓度最低限度为5%，复氧时的氧浓度为21%，间歇低氧组细胞分别给予1、3、6、8 h的低氧再氧合的循环操作，对照组细胞放置在适宜的培养箱中培养8 h。

1.2.3 收集细胞分泌液，将上清液装入EP管中，再加入适当裂解液，用刮板轻刮培养皿，将细胞装入EP管中，均置于冰上待用。

1.2.4 提取胞内蛋白，用全光谱酶标仪分别在450 nm、532 nm 处测过氧化氢酶（CAT），丙二醛（MDA）的吸光值，通过曲线换算，计算细胞内含量。

1.2.5 分别提取上清内蛋白和胞内蛋白，用Western blot方法，检测FSTL1和α-SMA表达的差异性以及趋势变化。

1.2.6 用siRNA转染的方法沉默成纤维细胞中FSTL1蛋白翻译，并同样间歇低氧处理8 h后，提取上清内蛋白做Western blot，验证是否沉默了FSTL1，提取胞内蛋白，再次用全光谱酶标仪测CAT、MDA的吸光值，通过曲线换算，计算细胞内含量。用提取的胞内蛋白和上清蛋白，通过Western blot方法检测Collagen 1蛋白和α-SMA蛋白的表达。沉默Fstl1的SiRNA 序列为 Sense：CCAUCAACAUCACCACUUATT，Anti-sense：UAAGUGGUGAUGUUGAUGGTT；对照组的 SiRNA 序列为 Sense：UUCUCC GAACGUGUCACGUTT，Anti-sense：ACGUGACACG UUCGGAGAATT。所有的序列都是5′端到3′端。

2 结果

2.1 间歇低氧模式诱导氧化应激反应 见图1。间歇低氧模式是一种利用正常氧浓度和低氧浓度交替循环来模拟睡眠呼吸暂停综合征夜间低氧的方法，之前的研究表明，间歇低氧模式能够诱导氧化应激反应，检测的指标主要有丙二醛（MDA）含量，过氧化氢酶（CAT）活力等。为了检验间歇低氧模式下诱导的氧化应激反应，我们将小鼠肺成纤维细胞置于呼吸仿真系统仓内，模拟间歇性低氧，检测不同时间点细胞中过氧化氢酶活力以及丙二醛的含量。我们发现对照组的过氧化氢酶活力和丙二醛含量最低，而随着低氧处理时间的增加，过氧化氢酶活力和丙二醛含量都呈现明显上升趋势。当在细胞培养基中加入抗氧化剂Temple处理8 h后，过氧化氢酶活力和丙二醛含量都显著下降了。以上实验说明间歇低氧模式确实能诱导氧化应激反应，并且与间歇低氧的时间成正相关性。

图1 小鼠肺成纤维细胞在低氧模式下氧化应激产物CAT和MDA的表达Fig 1 Expression of oxidative stress products CAT and MDA in mouse lung fibroblasts in hypoxia mode

2.2 间歇低氧模式诱导肺成纤维细胞中Fstl1的表达 见图2。利用Western Blot方法检测不同时间点经过间歇低氧处理的肺成纤维细胞中α-SMA和FSTL1的蛋白水平。结果显示，α-SMA蛋白水平随着低氧处理时间增加而明显增加，同时FSTL1蛋白的表达量在对照组中最低，随着间歇低氧处理时间越长，其表达量越高，而经过抗氧化剂temple处理后，α-SMA和FSTL1蛋白的表达量都有明显下降。以上数据说明间歇低氧能够诱导肺成纤维细胞活化以及FSTL1蛋白的表达，并且与氧化应激反应具有一定相关性。

图2 小鼠肺成纤维细胞在低氧模式下α-SMA和FSTL1的表达Fig 2 Expression of α-SMA and FSTL1 in mouse lung fibroblasts in hypoxic mode

2.3 敲低Fstl1减弱间歇低氧模式诱导的氧化应激反应 见图3。我们利用Fstl1的siRNA敲低肺成纤维细胞中FSTL1的蛋白，Western blot显示，siRNA确实降低了FSTL1蛋白的水平。而间歇性低氧处理后，细胞内丙二醛含量和过氧化氢酶活力都明显下降了。说明Fstl1参与调节间歇低氧模式的氧化应激过程。

图3 敲低FSTL1表达后小鼠肺成纤维氧化应激产物CAT和MDA的表达Fig 3 Expression of CAT and MDA in lung fibroblastic stress products of mice after knockdown of FSTL1 expression

2.4 敲低Fstl1减弱间歇低氧模式诱导的肺成纤维细胞活化 见图4。笔者进一步检测了在Fstl1表达下降的情况下，间歇低氧处理后肺成纤维细胞中α-SMA蛋白以及培养基中细胞外基质college1的表达量。结果显示，α-SMA蛋白以及collegen1的含量都显著下降，表明敲低Fstl1减弱间歇低氧模式诱导的肺成纤维细胞活化以及细胞外基质的合成。

图4 敲低FSTL1表达后小鼠肺成纤维细胞活化程度Fig 4 Activation of lung fibroblasts in mice after knockdown of FSTL1 expression

3 讨论

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征是一种由多种原因引起的睡眠呼吸疾病，造成夜间的低通气和白天嗜睡现象，临床上常见的原因是上呼吸道的狭窄。长期的夜间呼吸暂停和低通气，使得机体缺氧，血液系统、神经系统、内分泌系统等全身各个系统都受到间歇性低氧的影响，这种危害是广泛而且不可逆的，甚至常发生夜间猝死现象。该疾病的治疗方法主要有手术和非手术两种[9]，非手术治疗中以经鼻持续正压通气（NCPAP）最为有效，手术治疗的目的是消除或减轻呼吸道的阻塞，但这种方法个体性较强，有时不能完全治愈，会出现病情复发。FSTL1（Follistain-like 1）基因编码一种胞外分泌的糖蛋白，其几乎在所有的组织器官中均有表达[10]。研究表明，FSTL1通过增强TGF-b信号而促进肺纤维化的发展，是一个新的促纤维化因子。然而FSTL1是否参与氧化应激反应诱导的肺成纤维细胞活化并没有相关研究。有研究报道，Fstl1在特发性肺纤维化以及矽肺的活化肺成纤维细胞中均有明显上调。在之前的研究中发现，间歇性低氧能够诱导小鼠肺成纤维细胞的活化。本实验发现，经过间歇低氧处理后的FSTL1和α-SMA表达都高于正常组，且与低氧处理时间呈正相关[5，11-15]。用siRNA转染沉默FSTL1蛋白的表达，间歇低氧处理8 h后，α-SMA和collagen 1的表达量相较正常组都降低，氧化应激指标过氧化氢酶活力和丙二醛含量都下降，这在一定程度上表明FSTL1蛋白参与了此氧化应激的过程，与成纤维细胞的活化相关，有可能起到了促炎的作用。总的来说，睡眠呼吸暂停是一种全身性的疾病，对多个系统都有广泛影响，而这种影响体现在间歇低氧的这一机制对系统的损害，应该引起更多临床医生和科研工作者的重视。特别是OSAS患者是否有更高的发生肺纤维化的风险或者更严重的肺纤维化。接下来，应该完善从具体的氧化应激相关通路上做进一步的分析，尝试从信号分子上探索FSTL1蛋白和间歇低氧模式的关系，并搜集大量临床数据分析OSAS是否为肺纤维化的独立危险因素。