间歇性低氧干预提高心梗大鼠心功能和运动耐量

徐凯月，孟祥雪，黄 传，史 昱，万春晓

（天津医科大学总医院康复医学科，天津300052）

心血管疾病已成为威胁人类生存的重大疾病之一。尽管心血管疾病的治疗技术不断发展，但心肌梗死及其后的心力衰竭仍是现代社会心血管疾病死亡的主要原因[1]。2013年美国心脏协会数据统计，全美每天有至少2 200人死于心血管疾病。心肌梗死后会引起心肌纤维化，心脏收缩功能下降,心室扩张[2]，导致心脏功能减退，影响生存质量。因此，梗死后的心肌保护，对于心梗后人群提高心脏功能和改善生存质量具有重要意义。

心脏康复作为心血管疾病治疗中药物和手术的有效补充，在改善心脏功能方面得到广泛认可[3]。近年来，间歇性低氧干预在基础研究中得到关注，大量实验证明其能有效保护缺血再灌注大鼠的心肌，改善心脏功能[4]，但对于梗死后存活心肌的影响以及相关分子机制尚不明确。相关研究发现腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）在适应低氧和缺血应激的过程中发挥关键作用[5]。一方面，激活的AMPK可以通过抑制肿瘤坏死因子（TNF-α），减少细胞丝素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的释放，从而减少细胞凋亡[6]，降低心肌纤维化，减少心梗面积[7]；另一方面，可以通过增加葡萄糖的摄取[8]，从而促进骨骼肌收缩，提高运动耐量[9]。因此，AMPK能在保护心肌细胞、提高运动耐量等方面发挥重要作用。但间歇性低氧干预与AMPK的相关研究甚少，本实验拟通过构建大鼠心梗模型进行间歇性低氧干预，观察AMPK表达及心功能和运动耐量变化关系，旨在探究间歇性低氧干预对梗死后心肌的影响以及分子机制，从而拓展心脏康复方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 28只成年雄性SD大鼠，体质量220～250 g，购于北京华阜通有限公司。饲养地点为天津医科大学总医院动物实验室，室温为（23±2）℃，相对湿度为50%±10%，昼夜节律为12 h明暗循环。无菌饲料喂养，动物自由获取食物和水。

1.1.2 主要试剂 MASSON三色染色试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司，型号G1340)；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（美国Abcam公司）；HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（美国Abcam公司）。

1.1.3 主要仪器 小动物人工呼吸机（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司，型号DW3000）；有机玻璃动物低氧仓（山东烟台宏远氧业有限公司，型号DS-3）；动物实验跑台（北京众实迪创科技发展有限公司，型号ZS-PT）；超声仪（加拿大Visualsonics Inc公司，型号 Vevo770）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 按照随机数字表法将大鼠随机分为空白组（Sham，n=6）、空白低氧组（Sham-IH，n=6）、心梗组（MI，n=8）、心梗低氧组（MI-IH，n=8）。

1.2.2 动物模型制备 大鼠腹腔麻醉注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）后取仰卧位，使用小动物呼吸机辅助呼吸，对大鼠进行口腔插管，保持呼吸节律与呼吸机模式一致。备皮，胸骨左缘扪及心脏搏动处纵行切开皮肤约3 cm，逐层钝性分离，于第四肋间开胸，暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，以6/0缝线于左心耳根部下方2 mm处进针，进针深度0.5 mm，术中心肌颜色变白，心电图II导联显示ST段升高＞0.1 mV以上，确认为心肌缺血。待心电图ST段抬高稳定10min后，予以结扎。空白组大鼠以同样方法暴露心脏，但不进行左冠状动脉前降支的结扎。

1.2.3 干预方法 术后1周进行干预，将Sham-IH组和MI-IH组放入动物低氧仓内，模拟海拔5000m、氧浓度13%的低氧环境。每天干预4 h，每周5 d，共干预4周。Sham组和MI组放于常氧环境中，干预时间与低氧组相同。

1.2.4 运动耐量 干预4周后，将各组大鼠放于15°倾斜的跑台上，起始速度为6 m/min，每3 min速度增加3 m/min，至大鼠力竭为止，跑动的总距离作为大鼠的运动耐量[10]。

1.2.5 超声检查 分别在术后1周和干预4周后对各组大鼠行心脏超声检查，以Sham组大鼠为对照，使用M模块采集左心室射血分数，数值取测量3个心动周期的平均值。

1.2.6 免疫组织学染色 处死动物，取下心脏，生理盐水反复冲洗。在心脏结扎点至心尖部位取约厚度3 mm的横截面，置10%的福尔马林中固定。包埋制备石蜡切片，切成厚度7 μm石蜡切片，脱水并进行MASSON染色。胶原纤维成分呈蓝色，正常心肌呈红色。采用Image J图像采集软件计算心肌梗死面积所占比例（蓝色部分面积/蓝色+红色部分的总面积）并进行统计学分析。

1.2.7 Western blot法检测 提取心肌组织蛋白，冰上裂解并离心，取上清液存于EP管中。BCA法测定蛋白浓度，加裂解液保存于-80℃冰箱备用。配制不同浓度的浓缩胶，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电泳结束后转至PVDF膜上。TBST清洗，并用牛奶封闭2 h。4℃慢摇过夜孵育一抗，清洗后室温慢摇1 h孵育二抗。ECL化学发光试剂盒显色，并用Image J分析软件进行光密度值计算。

1.3 统计学处理 所有数据采用统计软件SPSS22.0和GraphPad Prism 6.0软件处理，并以±s表示。统计方法采用单因素方差分析及组间比较。P＜0.05认为具有统计学显著差异。

2 结果

2.1 免疫组织学染色比较 如表1所示，与MI组相比，干预4周后MI-IH组的梗死面积比例明显下降（P＜0.001）（图 1）。

表1 各组大鼠的心梗面积比例结果比较(±s,%)Tab 1 Comparison of infarct size ratio between groups(±s,%)

表1 各组大鼠的心梗面积比例结果比较(±s,%)Tab 1 Comparison of infarct size ratio between groups(±s,%)

MI-IH组与MI组比较，***P＜0.001

组别 n 心梗面积比例Sham 6 0 Sham-IH 6 0 MI 8 25.78±3.74 MI-IH 8 14.23±0.95***

图1 干预4周后，大鼠心脏石蜡切片MASSON染色（×40）Fig 1 MASSON staining of paraffin section for rats after four-week intervention（×40）

2.2 心脏超声检查结果比较 如图2所示，干预4周后，MI-IH组的左心室射血分数比干预前（Base）明显提高（P＜0.001），比4周MI组显著提高（P＜0.001），4周MI组比干预前也有提高（P＜0.05）。

图2 各组大鼠心脏超声检查结果Fig 2 Results of cardiac ultrasound between groups

2.3 运动耐量比较 如图3所示，干预4周后，各组的运动耐量均较干预前（Base）有明显增高（P＜0.001），MI-IH 组比 MI组出现显著增高（P＜0.001）。

2.4 AMPK蛋白表达的影响 如图4所示，干预4周后，MI-IH组AMPK表达比MI组明显增加（P＜0.05），同时比Sham-IH组明显增加（P＜0.01）。

图3 各组大鼠运动耐量比较Fig 3 Comparison of exercise tolerance between groups

图4 各组大鼠AMPK蛋白的表达情况Fig 4 The expressions of AMPK protein between groups

3 讨论

心肌梗死是当今世界主要的致死因素之一。随着现代科技的发展，药物和技术的开发应用以及管理模式的改进，心梗患者的死亡率显著下降[1]。梗死后存活患者如何改善心脏功能，提高运动能力，以及预防再梗死和心血管事件，已经成为心梗后关注的主要内容。欧洲心脏病学学会、美国心脏协会均将心脏康复列为心血管疾病治疗中最高级别I级推荐[11]。心脏康复对于提高心脏和运动能力具有重要作用[3]。在心脏康复研究中，间歇性低氧干预作为一种安全、无创、有效的方法，大多作为预处理手段应用于心肌缺血再灌注的研究中，发现可以减少氧化应激损伤和心肌梗死面积[4,12]。但是对于梗死后心肌的影响鲜有研究。

本研究发现，心肌梗死后存活大鼠进行间歇性低氧干预可以显著减少梗死面积和提高左心室射血分数。心梗面积减少使存活心肌增加，能提高心肌收缩力，改善射血分数[13]。射血分数是预测心肌梗死患者不良心血管事件和死亡率的重要指标[14]。射血分数明显下降的心梗患者一年内的不良心血管事件发生率与死亡率比左心室功能正常的心梗患者显著升高[15]。本研究通过心肌梗死面积比例和左室射血分数的变化，揭示了间歇性低氧干预对心肌梗死后大鼠的心脏保护作用。

运动耐量是体现机体活动能力的指标，对衡量心梗患者能否回归生活和工作具有重要意义[16]，同时也是预测心力衰竭和其他心血管疾病死亡率的重要因素[17]。运动耐量的提高能有效预防心血管病人的心力衰竭[18]，提高患者的生活质量。美国一项长达19年的多中心临床试验发现，心肌梗死患者的死亡率的下降与运动耐量提高密切相关，运动耐量每增加1 MET，死亡率随之降低8%～14%[19]。本研究显示4周干预后MI-IH组的运动耐量比干预前明显增加，同时比4周常氧干预的MI组明显增加，说明间歇性低氧干预有助于提高心梗后大鼠的活动能力，促进其更好地参与日常活动。

AMPK在控制炎症、调节能量代谢、保护心脏等方面发挥重要作用。相关研究发现，AMPK可以减少心肌细胞的凋亡[20]。Kim等[21]发现缺血再灌注小鼠模型心肌内激活的AMPK，可以减少心梗面积，产生心脏保护作用。本研究显示间歇性低氧干预4周后MI-IH组的AMPK蛋白表达明显增加，且研究中也证实了MI-IH组的心肌梗死面积比例减少，左室射血分数提高，提示心梗大鼠在间歇性低氧干预过程中，产生的梗死后心肌保护可能与心肌AMPK的增加有关。

本研究通过4周的间歇性低氧干预，从AMPK蛋白表达、心梗面积比例、射血分数、运动耐量方面证明了间歇性低氧干预对心梗大鼠会产生有效的心脏保护作用，提高活动能力，这可能与心肌AMPK增加有关。由于间歇性低氧干预对心梗康复的作用机制极其复杂，本研究仅探讨了AMPK在心梗后心肌保护中的变化，对于AMPK上下游的信号通路变化未有进一步的探索，后续研究中将深入探讨，为临床上心梗患者的心脏康复提供新思路。