恒河猴慢性酒精暴露肝损伤的多模态MRI实验研究

王 松，李 燕，余永强,，王海宝

酒精性肝损伤一直是临床和科研的研究热点之一，肝脏对酒精滥用的最早反应是肝细胞中的脂质积累，该病程是可逆的，可继续发展为酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌，脂肪肝也可直接发展为肝癌。肝脏活检仍旧是目前诊断和评估肝损伤的金标准，但它是一种侵入性手术，患者可能会出现不良反应及引起并发症，并难以进行动态观测，因此寻找出对酒精性肝损伤程度进行定量、无创的诊断方法显得尤为重要[1-3]。Le Bihan et al[4]首次提出了体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion,IVIM)的概念，将反映组织水分子扩散以及微循环灌注的参数分离开来。非对称回波的最小二程估算法迭代水脂分离技术(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation,IDEAL-IQ)则通过将水、脂二者的信号分离来获得脂肪分数(fat fraction,FF)。目前，国内外还未见对于酒精性肝损伤的动态研究及利用多模态MRI进行评价。该实验通过建立恒河猴慢性酒精暴露肝损伤模型，结合血液学指标，探讨多模态MRI技术无创、定量、动态评价酒精性肝损伤的可行性。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立购买7只健康恒河猴[河南省南阳市新野县新豫野生动物养殖有限公司(豫林护许准号)[2006]21号]，均为雄性，无酒精及相关乙醇类物质接触史，年龄7岁，体质量6.5～17.5(10.79±3.55) kg。喂养环境：单笼喂养，20～25 ℃室温，湿度55%～60%，每隔12 h调整光线明暗1次。建模过程如下：根据Cosgrove et al[5]报道的时间表程序诱导法逐渐增加乙醇(浓度为40%的瑞典绝对风味伏特加)用药量，用纯葡萄糖增加甜味并用自来水稀释乙醇，任由恒河猴自由口服，随着周数的增加，逐渐调整用药量，直至第5周达到3.2 g/(kg·d)后维持该用药量(第1周至第5周乙醇每天用药量分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 g/kg体质量)，诱导期在第5周结束。

1.2 MRI检查方法在建模前及维持期1个月末、3个月末及6个月末行多模态MRI扫描。应用GE Discovery MR 750 W 3.0 T 高场磁共振仪，单通道膝关节线圈，包裹腹部，仰卧，放置沙袋加压以抑制呼吸。扫描前采用3%戊巴比妥钠(剂量为1.0 ml/kg体质量)臀部肌肉注射的麻醉方法。MRI检查序列及参数如下：IDEAL- IQ序列：TR=10.5 ms，TE=3.3 ms，Flip Angle(翻转角)=3°，Bandwidth(接收带宽)=111.11，Slice Thickness(层厚)=2.0 mm，轴位扫描，Matrix 320×224， 扫描时间为55 s。RTr fs T2FSE ARC序列：呼吸触发序列，TR由呼吸频率决定，TE=80.3 ms,Bandwidth(接收带宽)= 83.33，Slice Thickness(层厚) =6.0 mm,Spacing=2.0 mm，Frequence(频率)为288，轴位扫描，Matrix 288×224，扫描时间为104 s。RTr Sag 3D T1 FSPGR序列：TR=3.7 ms，TE=1.8 ms，Flip Angle(翻转角)=3°，Bandwidth(接收带宽)=111.11，Slice Thickness(层厚)=2.0 mm，轴位扫描，Matrix 320×224，扫描时间为128 s。IVIM-DWI序列：呼吸触发序列,TR由呼吸频率决定，TE=Minimum，Slice Thickness=7.0 mm，Spacing=2.0 mm，Frequence(频率)=96，轴位扫描，Matrix 320×224，扩散采用X、Y、Z共3个方向，应用13个b值，分别为：0、10、20、30、50、100、200、300、500、600、800、1 000、1 200。单位为mm/s2，扫描时间230 s。

1.3 图像分析采用GE Work Station ADW 4.6图像后处理工作站中Function软件包内的MADC软件对所获得的IVIM-DWI序列数据进行后处理,使用统一的ROI测量范围，拟合常规图像与伪彩图，选择图像信噪比最高的层面，在肝左叶及肝右叶内各放置2个圆形ROI，尽量避开胆囊、胆管、血管、肝裂及韧带、肺内气体的影响，距离肝脏边缘至少5 mm，由2名放射科主治医师各测量1次表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)、真性扩散(true diffusion,D)、假性扩散(pseudodiffution,D*)、灌注分数(perfusion fraction,f)值后取平均值，记录并保存图像。选择IDEAL-IQ序列中的Fat Fraction图像，在图像信噪比最高层面勾画感兴趣区，在尽量避开血管、肝裂、胆囊及胆管、腹腔内脂肪组织及肺内气体等影响的情况下，尽可能勾画较大面积的感兴趣区, 测量并记录感兴趣区FF，保存图像。

1.4 血液学指标的获取MRI检查前，经小隐静脉采集4 ml静脉血来测定ALT、AST、三酰甘油、铁蛋白及血液酒精浓度。所有恒河猴麻醉前均禁食12 h，禁水4 h，并于扫描前12 h停止乙醇供给。

2 结果

2.1 一般情况7只恒河猴均实验成功，每次扫描前均将恒河猴称重，扫描结束后将动物安全送回动物房，清醒后6 h恢复正常饲食，各期体质量经单因素方差分析两两比较最小显著法(LSD)检验，F=0.124、P=0.945，差异无统计学意义。恒河猴酒精摄入量2.5～3.2(3.03±0.25)g/(kg·d)。检查前恒河猴血液酒精浓度为0～1.23 mg/ml。

2.2 IVIM-DWI序列所获IVIM-DWI序列中不同时间点ADC、D、D*、f值总体之间比较，ADC、D值之间差异有统计学意义(P=0.020、P=0.000)，D*、f值之间差异具无统计学意义(P=0.179、P=0.077)。其中，P0期、P1期、P2期与P3期之间ADC值差异有统计学意义；P0期与P1期、P0期与P2期、P0期与P3期、P2期与P3期之间D值差异有统计学意义。D*、f值各期之间差异均无统计学意义。见图1、表1。

图1 恒河猴肝脏IVIM-DWI序列图像A：ADC图；B：D图；C：D*图；D:f图表1 不同时间点恒河猴肝脏ADC、D、D*、f值之间的比较

时间点ADC(×10-3mm2/s)D(×10-3mm2/s) D∗(mm2/s) f(%)P0期1.450±0.2200.760±0.1310.078±0.028 0.275±0.056P1期1.460±0.2500.635±0.1160.078±0.0340.272±0.083P2期1.440±0.2600.647±0.1050.079±0.036 0.276±0.085P3期1.280±0.2400.581±0.127 0.078±0.037 0.276±0.091P值0.0200.0000.1790.077

2.3 IDEAL-IQ序列所获FF图像中不同时间点FF总体之间比较，差异有统计学意义(F=9.417,P=0.000)，各时间点之间FF两两比较，P0期、P1期及P2期与P3期之间差异有统计学意义。见表2、图2、3。

2.4 MRI参数与血液学指标相关性分析ADC值与三酰甘油指标、AST指标呈显著性负相关(r=-0.559、-0.581)；D值与三酰甘油指标呈显著负相关(r=-0.531)；D*值、f值与各血液学指标均无显著相关性；FF与三酰甘油指标、AST指标呈显著正相关(r=0.620、0.690)；FF与ADC值、D值呈显著负相关性(r=-0.707、-0.523)。见图4。

表2 不同时间点恒河猴肝脏

图2 恒河猴肝脏FF图像

图3 各时间点FF变化

3 讨论

早期的肝损伤是可逆的，因此在该期发现并定量判断其损伤程度显得尤为重要，而传统的诊断方法均具有一定局限性。基于双指数模型理论的IVIM-DWI成像可以将组织的真实扩散和微循环灌注两种信息分离出来，IDEAL-IQ成像则可反映酒精性肝损伤早期肝脏脂肪含量的改变，二者可定量分析肝脏病理生理状态的改变来评估肝损伤的程度，早期动态、无创地发现肝脏细微的改变。

每只恒河猴在维持期内的酒精摄入量达到了Vivian et al[6]定义的对于重度饮酒者的乙醇摄入量要求，平均乙醇摄入量>3.0 g/(kg·d)。四期体质量比较差异无统计学意义，说明总体能量的摄入是较稳定的。每次扫描前12 h最后1次喂酒，检查前恒河猴模型血液酒精浓度为0～1.23 mg/ml，说明该实验受酒精急性损伤影响较小。同时，根据王东 等[7]的研究，表明该恒河猴慢性酒精暴露肝损伤模型成功建立。

本研究显示，P0期、P1期、P2期的ADC值均与P3期有显著性差异；P0期与P1期、P0期与P2期、P0期与P3期的D值均有显著性差异，并且ADC值与D值均与三酰甘油指标、FF呈显著负相关，说明ADC值及D值可在一定程度上反映酒精性肝损伤肝细胞脂肪变性与脂肪沉积的程度，D值较ADC值来说在酒精性肝损伤早期即可对其进行很好的区分。

长期过量饮酒会引起肝纤维化，使肝脏内自由水的布朗运动受限和门静脉血流灌注减少。水分子运动的快慢虽然可以通过ADC值反映，但ADC值同时也受微循环的灌注作用影响，缺乏特异性。在低b值时，主要反映的是灌注效应，所测ADC值偏高于D值，从而降低了ADC值的检验效能[8-10]。作为真实扩散系数的D值代表了纯水分子的扩散效应,其指标相对ADC值来说则更具有特异性。这是因为除了大量纤维结缔组织弥漫性增生并沉积而限制了水分子的扩散运动外，肝细胞变性水肿、炎性细胞浸润、其他物质如脂肪和铁沉积等改变亦会能对水分子的扩散造成一定的影响[10-11],所以纯水分子扩散系数D值较ADC值提高了对慢性酒精暴露肝损伤的诊断特异性,与Yoon et al[12]的相关研究结果一致。

本研究D*值在各期之间比较差异均无统计学意义,可能本研究中各期均未见或仅有少量胶原纤维沉积，而肝内炎性细胞浸润及肝细胞肿胀变性等才是最主要的病理学改变，肝小叶结构未出现明显变化，所以对肝脏微循环的灌注未起到改变作用或者作用很小，因此慢性酒精暴露前后各期D*值无明显差异。相应的，慢性酒精暴露前后各期f值亦无明显差异[13]。

图4 MRI各参数指标与血液学指标关系散点图

A：甘油三脂与ADC值相关性分析；B：AST与ADC值相关性分析；C：甘油三脂与D值相关性分析；D：甘油三脂与FF相关性分析；E：AST与FF相关性分析；F：ADC值与FF相关性分析；G：D值与FF值相关性分析

IDEAL-IQ 技术是由IDEAL技术改进而获得的，一次屏气扫描可获得水像、脂像和FF图像[14-15]，并且无需进行复杂的后处理。在本次实验中，采用MRI IDEAL-IQ序列测得的恒河猴肝脏的FF及三酰甘油含量不断上升，并且所测得FF与血液三酰甘油指标结果之间呈显著正相关，与陈晓 等[15]的研究结果相类似，因此可将MRI IDEAL-IQ技术所测得的肝脏FF作为评价是否有慢性酒精暴露肝损伤以及严重程度的一个可靠指标。

本实验的不足在于：① 样本量较小,有待增加样本量进一步研究；② 虽然恒河猴是非人灵长类动物模型，相对于其他实验动物，在该研究中具有优势，但是动物模型研究结果并不能代表真实的结果，动物与人之间翻译桥建立是难点，有待进一步研究。

综上，利用多模态MRI可对慢性酒精暴露肝损伤进行定量评价，IVIM-DWI序列上表现为ADC值、D值降低，IDEAL-IQ序列上表现为FF增加，部分参数与血液学指标之间呈显著正相关或显著负相关。非人灵长类动物疾病模型的建立对临床相关疾病研究具有重要参考价值。