变应性鼻炎患者鼻黏膜微小RNA的表达谱及其意义

冯 娟，张秀利，阳玉萍，王 燕，张 华

(1新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，乌鲁木齐 830054； 2新疆乌鲁木齐市中医医院，乌鲁木齐 830000)

变应性鼻炎(allergicrhinitis，AR)是一种鼻黏膜的变态反应性疾病，其发病受到遗传和环境因素的双重影响，可以被认为是一种多基因遗传性疾病。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码RNA，在机体的一系列生理和病理过程中起到重要的作用[1-2]。近年研究表明，miRNA参与调控肥大细胞和嗜酸性粒细胞的发育、活化等生物学过程[3-4]，靶向干预这些细胞内的miRNA表达，可成为AR基因治疗的新途径。目前，越来越多的研究者在AR患者鼻黏膜中发现miRNA的差异表达[5]，基于二代测序的RNA-seq分析技术可利用很少的生物样本量进行测序分析并能预测新的剪切体、非编码RNA，利用高技术可进行高通量的筛选分析。本研究采用RNA-seq分析技术，对AR患者局部鼻黏膜miRNA表达谱进行筛选分析，分析出部分与AR发病相关的关键新预测的miRNA，为进一步深入研究AR的发病机制、诊断及治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料及取样所有病例来自2015年9-12月在新疆医科大学第一附属医院耳鼻喉科住院患者，年龄18～50岁，性别不限，AR组为变应性鼻炎合并鼻中隔偏曲患者，AR诊断符合2015年天津会议《变应性鼻炎纳入标准》。对照组为单纯鼻中隔偏曲患者。否认变应性鼻炎病史。排除标准：慢性鼻-鼻窦炎、上颌窦后鼻孔息肉、支气管哮喘和自身免疫性疾病。本研究所采用的标本通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会标准，并征得患者知情同意。6例样本的一般资料如下：1号样本：男性，48岁，对照组；2号样本：女性，26岁，对照组；3号样本：男性，21岁，AR组；4号样本：男性，36岁，AR组；5号样本：女性，20岁，AR组；6号样本：男性，28岁，对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 组织样本收集 剪取鼻腔黏膜组织前，用生理盐水冲洗鼻腔，获得样本后，迅速将其放入RNase-free的0.9%的生理盐水中漂洗，去除血渍和污物，将准备好的冻存管装载包裹组织。迅速投入液氮中冷却，将样本转入-80℃冰箱待用。

1.2.2 组织总RNA提取与质量检测 选择保存于-80℃冰箱中的鼻黏膜标本约50 mg。至于液氮预冷的研钵中，研磨组织，采用Trizol法提取组织中RNA，采用NANO Drop 2000c分光光度计测定RNA浓度和纯度，A260/A280比值1.8～2.1，浓度越高越接近2.0，采用变性琼脂糖凝胶电泳法检测RNA纯度，在紫外光下观察28S、18S条带情况。

1.2.3 miRNA检测识别及定量分析 miRNA的检测，经3′接头，5′接头，反转录，PCR扩增，文库扩增等步骤，具体技术路线见图1。

图1 miRNA检测识别技术路线

1.3统计学处理采用SPSS17.0统计软件包对数据进行分析，数据符合正态分布时，采用独立样本t检验，不符合正态分布时用两组的独立样本的秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用R软件包(版本2.13.2)进行相关数据分析，利用t检验，以P值和误判率(false discovery rate，FDR)，筛选出2组间差异表达的miRNA，筛选标准为P值和FDR值<0.05，miRNA上调判断：均值倍数(fold change)>1，miRNA表达下调：均值倍数(fold change)<1。

2 结果

通过miRNA芯片，检测共有172个新预测的miRNA在AR和非AR鼻黏膜组织中表达，而AR组标本中检测到表达的miRNA(至少在1个生物学重复中miRNA表达水平>0)共有351个(其中3、4、5号患者分别有104、113、134个miRNA表达)，有84个预测的miRNA在变应性鼻炎组共同表达。在非变应性鼻炎组1、2、6样品中检测到表达的miRNA有342个(其中1、2、6号患者分别有115、100、127个miRNA表达)，有85个预测的miRNA在非变应性鼻炎组共同表达。

2.1 small RNA注释将所有序列与rfam数据库进行比对，得到其中sRNA，如miRNA、rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA等的分布情况。以3号样本(AR组)为例，得到的其reads长度分布图，见图2。

图2 3号AR患者rfam注释饼图

2.2 新miRNA预测及表达量分析通过miRNA前体的发卡结构，预测miRNA，将miRNA比对到基因组序列，截取其两侧序列进行二级结构预测，通过Dicer酶结合位点其二级结构的自由能的情况，预测新的miRNA。表1为本研究得到的表达量居前20位的新预测的miRNA，根据本研究结果显示，新预测miRNA相关信息示意图见图3。

测序得到的原始图像数据经过Base Calling转化为序列数据，下机数据质量分布图见图4。

图3 新预测miRNA相关信息示意图

(左上角为预测得到的前体的临时编号、各项得分、总的序列数以及比对到mature、loop和star区的序列数；右图为miRNA前体预测的二级结构；中间的折线图横坐标为miRNA前体序列碱基位置，纵坐标为比对上序列频率，下面为该miRNA前体碱基序列及其结构编码以及比对到该miRNA不同区域的序列信息，包括序列及序列数目、失配碱基数和所属样本。)

表1 新预测miRNA表达量统计表miRNA

图4 下机数据质量分布图

注：横坐标为碱基位置，纵坐标为碱基质量分布情况

对于得到的含有相应index的数据，为了得到更高质量及更精准的生物信息分析结果，需要对数据做进一步的质控筛选。以3号样本(AR组)患者为例，得到的其reads长度分布图，见图5。

图5 3号AR患者reads长度分布图

2.3样本间差异表达的新预测的miRNA分析对于前面得到的新预测的miRNA根据其表达量进行样本间差异分析，分别用edgeR与DESeq2进行表达量差异分析[6-7]，取二者交集作为最终结果。本研究数据得到6个新预测的miRNA(12_8883、1_337、15_10712、2_2607、5_4078、8_6355)在样本间差异表达(P<0.05)，见表2。

表2 样本间差异表达的新预测的miRNA

2.4 新miRNA靶基因预测对于得到的已新预测的miRNA，使用软件miRand、RNAhybrid预测其靶基因。为了进一步提高结果的准确性，使用不同软件分别预测取最终交集作为结果。以新预测的miRNA12_8883为例，其对应有34个靶基因，见表3。

2.5 差异表达的新预测的miRNA表达模式分析对差异表达的新预测的miRNA进行表达模式聚类分析，以热图展示，见图6。

表3 miRNA12_8883对应的靶基因

图6 差异表达的新预测miRNA表达聚类图

2.6 差异表达miRNA靶基因富集差异表达miRNA与8条通路有关，分别是轴突指导(axon guidance)、突触小泡循环(synaptic vesicle cycle)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、胞吞作用(endocytosis)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、Ras信号通路(Ras signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)和赖氨酸降解(lysine degradation)，见表4。

3 讨论

新一代测序技术的出现，为探索生物体内的miRNA提供了一条捷径。利用新的测序技术，将可以获取任意物种的全部miRNA序列信息，而不必担心有所遗漏。高通量测序技术(high-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(next-generation sequencing technology)，即二代测序，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，高通量测序技术可以实现百万甚至千万个DNA分子的并行测序，在测序通量、周期与成本上都有根本性突破。

近年来，医学界对miRNA的研究已经取得了突破性进展，虽然涉及AR病理机制的miRNA逐渐被发现，但仍有许多未知的miRNA，通过研究发现未知miRNA，有望成为今后miRNA的研究方向。本研究用RNA-seq分析技术，对AR患者局部鼻黏膜miRNA表达谱进行筛选分析，最终得到172个新预测的miRNA，6个新预测的miRNA(12_8883、1_337、15_10712、2_2607、5_4078、8_6355)在样本间差异表达(P<0.05)。进行miRNA表达谱实验，就是为了筛选在样本具有重要表达功能的、能更好地体现差异实质的miRNA[8]。可以将本研究预测得到的差异表达的新预测的miRNA为研究基础，后续研究可针对差异表达的miRNA，在细胞水平揭示变应性鼻炎差异表达miRNA在AR发生、发展过程中的重要作用，进一步研究可为AR的临床治疗提供新的方向与靶点。

表4 差异表达miRNA靶基因富集

京都基因和基因组百科全书(KEGG)是基因功能系统分析的知识库，可以将基因组信息与高阶功能信息联系起来。基因组信息存储在GENES数据库中，该数据库是所有完全测序的基因组的基因目录的集合，以及具有基因功能的最新注释的一些部分基因组。更高阶的功能信息存储在PATHWAY数据库中，该数据库包含细胞过程的图形表示，如代谢、膜转运、信号转导和细胞周期等信号通路。PATHWAY数据库由一组直系同源组表补充，用于保存的子途径(途径基序)信息，这些信息通常由染色体上的位置偶联基因编码，并且特别适用于预测基因功能。KEGG的第3个数据库是LIGAND，用于获取有关化合物，酶分子和酶促反应的信息。本研究选取AR患者标本，采用KEGG数据库，对筛选出的差异表达的miRNA，采用Fisher精确检验和卡方检验的统计学方法，将miRNA参与的信号转导通路(简称pathway)进行显著性分析，按照P<0.05的标准进行筛选，得到差异表达新的miRNA与8条通路有关，8条通路分别是轴突指导(axon guidance)、突触小泡循环(synaptic vesicle cycle)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、胞吞作用(endocytosis)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、Ras信号通路(Ras signaling pathway)、黑色素瘤(melanoma)和赖氨酸降解(lysine degradation)。

用基因芯片技术对变应性鼻炎进行研究，筛选新的差异表达的miRNA，可以为疾病的诊断与治疗提供理论依据，本研究初步分析了变异性鼻炎新预测的差异表达miRNA。证实了变异性鼻炎受多种miRNA调控，并筛选部分可能与其发病有关的新的miRNA，为下一步深入研究变异性鼻炎的发病机理以及诊断治疗提供了新的思路。

现代研究学者普遍认为，AR和哮喘为“同一气道同一疾病”的结论[9-10]。AR也被认为是哮喘发病的独立危险因素，但AR并发哮喘的机制尚未阐明，后续实验可进一步开展AR合并哮喘的miRNA筛查，发现其相关联miRNA进行进一步研究。另外，本研究存在一定的不足，由于时间和实验经费的限制，本组测序分析检测的病例只有6例，通过本研究的初期研究，可进一步研究某个或某几个特征miRNA与AR的相关性，从而得到诊断新标准或者是AR的治疗新靶点。