阻断Rho/Rock信号通路联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠神经功能修复的影响

李忠伟，张树文，贺 苗，陆 帅，郭财进，陈 曦

(新疆医科大学1第一附属医院，2护理学院，乌鲁木齐 830011)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)具有致残率高、后期康复及生活负担重等特点，骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)作为种子细胞定向移植可促进SCI修复及功能恢复已得到广泛的证实[1]。但是，BMSCs定向移植后因细胞生长环境改变、脊髓原发性损伤炎性反应以及脊髓损伤后相关抑制性信号通路开放所致继发性损伤导致移植细胞出现凋亡、生长缓慢、分化抑制等难题[2-3]。相关文献认为继发性损伤所导致的病理生理变化对神经功能恢复起决定性作用，而相关抑制性信号通路开放所致趋化因子和细胞因子的活化正是SCI后招募、激活炎性细胞的扳机点，从而进一步加重SCI的继发性损伤[4-5]。细胞移植后生长环境改变、脊髓原发性损伤炎性反应难以避免，脊髓损伤可致使Ras同源基因/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho/Rock)、Notch等多条信号通路的激活，这些以Rho/Rock为终末的信号通路均可激活炎性因子、加速细胞凋亡、抑制轴突再生从而抑制脊髓损伤的修复及神经功能的恢复[6]。因此，本研究将Rho/Rock信号通路阻断剂应用于SCI大鼠治疗当中，旨在探讨阻断Rho/Rock信号通路联合骨髓间充质干细胞移植于脊髓损伤大鼠后对其神经功能修复的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选取5只周龄为3～4周、体质量为100 g健康雄性SD大鼠用于BMSCs的提取，选取80只周龄为8周、体质量300 g雄性SD大鼠用于制作模型。SD大鼠均为清洁级，由新疆医科大学动物饲养中心提供，本研究经新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准(编号：IACUC20161208-05)。将80只大鼠根据不同实验干预措施随机分为SCI模型组、BMSCs移植组、Fasdiual治疗组、联合治疗组(20只/组)。

1.2 试剂及仪器设备胎牛血清、低糖DMEM培养基、PBS缓冲液、双抗、0.5%胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；神经元性特异性烯醇化酶(NSE)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体及四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的羊抗兔IgG抗体、二脒基苯基吲哚(DAPI)复染液(武汉博士德公司)，神经丝蛋白(NF200)抗体(北京博奥森公司)。超净工作台(苏净安泰)，高速离心机(美国Thermo公司)倒置相差显微镜(Carl Zeiss)，恒温培养箱(美国Thermo Hera Cell)，图像采集设备(fecia DM3000)。

1.3BMSCs的提取、培养、纯化及鉴定无菌条件下取出5只周龄3～4周、体质量为100 g大鼠的双侧股骨及胫骨，置于5%双抗的DMEM中，用低糖DMEM反复冲洗骨髓腔，反复吹打成单细胞悬液，清洗、离心细胞2次去除肉眼可见的杂质及油脂。用含体积分数12%胎牛血清的DMEM制作单细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，72 h首次换液弃去未贴壁的悬浮细胞，之后每3天换一次液，当细胞生长至80%～ 90%时，进行胰酶消化传代(1∶3传代)，第3代细胞已经去除非贴壁的骨髓造血干细胞，得到纯化的BMSCs，使用流式细胞计数进行检测。移植前用毛细吸管反复吹打分离细胞，制作单细胞悬液，PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106个/μL，移植备用。

1.4 SCI大鼠模型制作取SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)后，麻醉生效后固定于解剖板上备皮消毒，以胸10为中心做5 cm长切口，逐层分离暴露胸9、10、11棘突和椎板，咬除棘突及椎板充分暴露脊髓。根据改良Allen法用5 g砝码从16 cm高度通过适当粗细的玻璃试管自由下落，砝码柄端朝下，打击面积约3.0 mm2。砝码自由落下打击到脊髓时大鼠迅速出现双下肢回缩扑动及摆尾动作，随后出现迟缓性瘫痪，迅速移除砝码后可见脊髓充血水肿，提示SCI模型制作成功，生理盐水冲洗后逐层关闭切口。术后膀胱按摩3～5次/d，促进反射性排尿至恢复正常排尿，20万U/kg青霉素皮下注射3～5 d预防切口及泌尿系感染。

1.5 干预方法SCI模型组：脊髓损伤模型制作成功后逐层关闭切口，30 min后腹腔注射1 mL的0.9%氯化钠注射液。BMSCs移植组：脊髓损伤模型制作成功后30 min腹腔注射1 mL的0.9%氯化钠注射液，术后5 d沿原切口切开暴露脊髓损伤节段，硬膜下注射10 μL的1×106/μL骨髓间充质干细胞单细胞悬液。Fasdiual治疗组：脊髓损伤模型制作成功后30 min腹腔注射1 mL的Fasdiual (0.85 mg/kg)，术后5 d沿原切口切开暴露脊髓损伤节段，硬膜下注射10 μL 0.9%氯化钠注射液。联合治疗组：脊髓损伤模型制作成功后30 min腹腔注射1 mL Fasdiual (0.85 mg/kg )，术后5 d天沿原切口切开暴露脊髓损伤节段，硬膜下注射10 μL 1×106个/μL骨髓间充质干细胞单细胞悬液。

1.6 运动功能评分由本课题组2名研究人员采用BBB(basso-beattie-bresnahan)评分法分别于SCI术后第1、7、14、21、28天同一时间段对各组大鼠后肢运动功能进行评分，评分范围0～21分，0分为无后肢运动，21分为后肢正常运动，评分取平均值。

1.7 组织学观察SCI术后第28天各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉处死各组SCI大鼠，按原切口进入，以损伤脊髓节段为中心切取约1 cm长度完整脊髓组织，置于4%多聚甲醛固定48 h，常规梯度脱水、石蜡包埋。取蜡块制片，厚度4 μm，60℃烤箱烤片过夜备用。切片经脱蜡、脱水、透明后分别进行HE、免疫组织化学、免疫荧光染色，镜下观察脊髓标本形态学结构以及NSE、NF200、GFAP的表达。

1.8 免疫组织化学半定量分析采用Image-Rro-Plus图像分析软件对免疫组织化学染色结果进行分析，根据阳性染色细胞及染色强度计算出光密度值，用于后续统计分析。

2 结果

2.1 细胞形态及鉴定初次换液后原代细胞呈集落分布于培养瓶，经传代后均匀生长，3代细胞均匀分布，细胞呈梭形。3代细胞表型CD29、CD45的阳性率分别为82.4%、2.0%，见图1。

2.2 BBB评分各组SCI大鼠术后1 d评分均位于较低水平，运动范围为无运动到1～2个关节的轻微运动，术后1～28 d各组SCI大鼠运动功能均有改善，以术后14～28 d改善幅度相对较大，以联合治疗组运动改善效果最佳，联合治疗组在损伤第14天开始SCI大鼠BBB评分逐渐优于其余治疗组，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 HE染色SCI术后第28天观察各组标本HE结果显示联合治疗组脊髓伤修复效果明显，脊髓空洞面积最小，其次为BMSCs移植组和Fasdiual治疗组，而SCI模型组空洞面积最大，损伤组织的修复效果较差，见图2。BMSCs移植组、Fasdiual治疗组和联合治疗组分别与SCI模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图1 3代BMSCs细胞的鉴定结果

表1 SCI大鼠术后不同时间点BBB评分(分，±s，n=20)

注：与SCI模型组比较，*P<0.05; 与BMSCs移植组比较，▲P<0.05； 与Fsadiual治疗组比较，△P<0.05。

图2 SCI标本28 d时HE染色观察(×200)

表2 SCI大鼠术后28 d脊髓空洞面积比较(mm ±s，n=20)

注：与SCI模型组比较，*P<0.05； 与BMSCs移植组比较，▲P<0.05； 与Fsadiual治疗组比较，△P<0.05。

2.4 免疫组织化学染色免疫组织化学染色结果显示NSE、NF200、GFAP在各组均有阳性表达。半定量分析结果显示NF200、NSE在联合治疗组阳性表达显著高于其他各组，差异具有统计学意义(P<0.05)。BMSCs移植组和Fasdiual治疗组的NSE、NF200的阳性表达分别与SCI模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；GFAP以联合治疗组阳性表达最少，与其他各组相比差异均有统计学意义，其次为BMSCs治疗组和Fasdiual治疗组，分别与阳性表达最高的SCI模型组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。半定量分析见表3。

2.5 免疫荧光染色免疫荧光染色结果显示免疫荧光染色可见神经特异性标志物NF200、NSE、GFAP在各组均有阳性表达。NF200、NSE在各组细胞胞质周围呈红色荧光，并且在SCI模型组、BMSCs移植组、Fasdiual治疗组和联合治疗组中荧光密度逐渐增强；GFAP荧光呈放射状分布，在SCI模型组、BMSCs移植组、Fasdiual治疗组和联合治疗组中荧光密度逐渐减弱。本研究均未发现NF200、NSE、GFAP在各组荧光强度有显著性变化，见图4。

图3 SCI标本28 d免疫组织化学染色观察(×400)

注：NSE分布于脊髓灰质区，各组脊髓灰质区损伤程度与脊髓背侧打击区均较轻，NF200、GFAP在脊髓区域均有分布；SCI模型组脊髓打击区结构紊乱，损伤区空洞形成，BMSCs移植组、Fasdiual治疗组较SCI模型结构紊乱及空泡变性程度较轻，两组无明显差异，联合治疗组较前3组相比病理结构明显减轻，仍有少量空泡变性。

表3 各组大鼠脊髓组织各蛋白表达的半定量值分析

注：与SCI模型组比较，*P<0.05； 与BMSCs移植组比较，▲P<0.05； 与Fsadiual治疗组比较，△P<0.05。

3 讨论

脊髓损伤(SCI)由初始的原发性和渐进的继发性两部分损伤共同所致[7]。目前，因各种外伤因素造成脊髓结构破坏的原发性损伤还无法可控，仅限于手术解除压迫为脊髓恢复创造有利条件；然而，以脊髓水肿、炎症反应、神经细胞凋亡、神经元不能再生一系列联动的继发性损伤是可以干预的，也是当前解决脊髓损伤再生修复的研究方向[7]。脊髓损伤后轴突再生和正确靶向是损伤后脊髓修复与功能重建的难点，干细胞移植治疗脊髓损伤能很好解决这一难题，其中的BMSCs定向分化移植是最具应用前景之一[1,8]。但由于BMSCs移植于损伤脊髓后会继发性损伤出现移植细胞生存率下降、生长缓慢、定向分化抑制等不利的方面。所以，本课题以此为据点进行研究。

相关文献认为脊髓损伤后相关抑制信号通路开放所致继发性损伤所导致的病理生理改变是神经功能恢复的关键因素[6]。脊髓损伤后可抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号通路、Notch信号通路、Ras同源基因/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho/Rock)信号通路等多条信号通路，它们均能激活的Rho来传导抑制信号[9]，再激活下游效应因子Rho相关蛋白激酶Rock，影响细胞内变化并导致再生轴突的生长锥塌陷及神经突触回缩，各种分子机制调控使 Rho在实现信号转导过程中承担着“分子开关”的作用。因此，通过抑制脊髓损伤后再生抑制信号通路的关键汇聚点Rho/Rock信号通路对脊髓损伤修复至关重要[10]。因此，本研究将阻断Rho/Rock信号通路与骨髓间充质干细胞移植相结合应用于SCI大鼠治疗中，旨在观察两者联合后对脊髓损伤大鼠是否能更好地实现神经功能的修复。

图4 SCI标本28 d免疫荧光染色观察(×200)

注：NF200、NSE在各组细胞胞质周围呈红色荧光，GFAP荧光呈放射状分布；免疫荧光结果显示各组荧光强度无显著性变化趋势。

本研究显示，脊髓损伤模型制备成功后，各组大鼠BBB评分均较低，随着观察时间的延长，脊髓修复及神经功能恢复可有一定程度的改善，与其他脊髓半切实验不同，本研究采用本课题组前期实验改良Allen重物打击法进行模型制备，此方法简单，可操作性强，研究采用5 g 砝码、16 cm 高度自由落体打击，属于重度损伤组[11]。SCI时大鼠可以看到很明显的双后肢抽动及摆尾动作，随后出现双后肢瘫痪状态，麻醉苏醒后呈双后肢拖动行走，针刺反应可出现双后肢的轻微收缩，同时伴有尿潴留，属于一种不完全性损伤，为后期脊髓修复及神经功能恢复提供了可能性。杨新明等[12]探讨丙戊酸(VPA)联合BMSCs促进大鼠急性脊髓损伤，联合治疗组SCI术后14 d BBB评分为(9.76±0.95)分，结果明显优于VPA、BMSCs单独治疗组及SCI模型组。本研究通过BBB运动功能评分观察发现，SCI大鼠脊髓损伤后第1、7天各组BBB评分均无统计学差异(P>0.05)，脊髓损伤干预后第14～28天，BBB评分逐渐出现差异性变化，并且干预组优于SCI模型组，说明BMCSs移植组和Fasdiual均能促进SCI大鼠后肢功能的恢复，联合治疗可以更进一步加强后肢运动及神经功能的恢复。

NF200、NSE作为反映神经干样细胞的特异性标志物蛋白，可反应脊髓组织中神经干样细胞的表达量，对维护神经细胞的功能及神经组织的损伤修复发挥重要作用；这两种蛋白是髓鞘的轴突中含量最多的蛋白，同时也对维持神经细胞的形态结构和轴浆运输以及与损伤神经的修复具有极其重要的意义。脊髓损伤后由于各种不利因素导致损伤区细胞变形坏死、结构破坏及细胞崩解，失去其原有的功能，但损伤区周围的细胞可通过合成这两种蛋白来修复受损的神经细胞[13]。GFAP是星形胶质细胞的特异性标记物，在缺氧缺血后的反应性胶质细胞中明显表达，同时也能反映中枢受损后的严重程度，也间接地反映受损区域无菌性炎性改变，促进炎性物质产生从而抑制神经功能的恢复[14]。本研究观察结果显示NF200和GFAP在整体脊髓中均有表达，而NSE在脊髓灰质中的表达明显。本研究从BMSCs移植组和Fasdiual治疗组脊髓组织切片免疫组化及免疫荧光染色结果中发现NSE、NF200阳性表达均高于SCI模型组，提示BMSCs移植和阻断Rho/Rock信号通路均可促进神经细胞特异性标志蛋白的表达；BMSCs移植组和Fasdiual治疗组中的GFAP阳性表达低于SCI模型组，研究结果显示BMSCs移植后可减少局部组织中GFAP阳性表达，表明BMSCs可抑制星形胶质细胞，可反映出其调节炎症机制促进SCI大鼠的脊髓修复，这是BMSCs移植治疗SCI大鼠的一个重要机制，其主要通过上调抗炎因子及下调趋化因子来实现对炎症反应的主导调节作用[15]；同时结果显示，阻断Rho/Rock信号通路使得GFAP阳性表达降低，减少局部损伤区炎症反应，从而达到减少脊髓的继发性损伤的目的，为BMSCs移植正向修复提供了保障；联合治疗组的NSE、NF200的阳性表达均高于其他各组，而GFAP表达反之，这一研究结果提示两种治疗方式联合能够起到促进脊髓修复的协同作用。

从本研究结果得出，各治疗组疗效优于SCI模型组，其中以联合组疗效最为显著，表明BMSCs移植与Rho/Rock信号通路阻断剂均可促进脊髓修复及神经功能的恢复，且BMSCs移植联合Rho/Rock信号通路阻断剂具有更好的疗效，两者之间存在一定的协同效应。结合相关文献分析BMSCs移植在局部分化为神经干样细胞后分泌抗炎因子、神经营养因子等改善脊髓受损区域的微环境，促进微血管生成、减少细胞凋亡、促进轴突生长，对局部损伤区域起到神经营养及保护的作用[8,16-17]，从而减少脊髓的继发性损伤，加快损伤区域的脊髓修复。既往相关研究也发现干细胞联合应用能取得较好的疗效，曾志谋等[18]研究发现骨髓间充质干细胞联合促红细胞生成素治疗大鼠脊髓损伤取得较好的疗效，认为联合治疗可减少脊髓的出血、水肿，减轻炎性反应；郑竑等[19]研究干细胞靶向移植联合促红细胞生成素亦能改善SCI大鼠的预后。结合张小宁等[20]，董春磊等[21]研究，分别通过BMSCs向神经干样细胞诱导分化后移植以及BMSCs联合减重步行训练观察SCI疗效，均得出神经干样细胞是促进神经功能恢复的主要原因，因此推断本研究中BMSCs向神经干样细胞的诱导分化可能是促进神经修复的重要机制之一。相关研究证实通过阻断Rho/Rock信号通路可促进BMSCs轴突导向及树突棘形态发生，促进细胞轴突和树突生长，同时Rho/Rock通路在CNS炎症调控中也发挥着不可忽视的作用，抑制Rock能减少白细胞向脊髓的渗透，因此，控制炎症也可能是抑制Rho/Rock信号转导发挥脊髓保护作用的重要机制之一。因此，本研究认为联合治疗可以维持受损脊髓节段神经干样细胞的生理功能，可能的机制是减少了受损脊髓节段神经干样细胞的死亡及维持原有的生存状态和功能，或是抑制Rho/Rock信号通路可促进移植的BMSCs向神经干样细胞的定向分化，但是具体机制还需进一步深入研究。

综上，本研究通过阻断Rho/Rock信号通路和BMSCs移植均可促进SCI大鼠神经功能的修复，且两者联合应用促进脊髓修复方面上有协同作用，能更加有效地促进SCI大鼠神经功能恢复。但仍需进一步实验探索Rho/Rock信号通路和BMSCs联合治疗促进SCI大鼠神经功能恢复的协同机制，以此为脊髓损伤的基础治疗提供一定的理论依据。