耐镉功能内生菌的筛选及其固定化处理含镉废水

2019-10-16石先阳

生物学杂志 2019年5期

杨培，石先阳

(安徽大学资源与环境工程学院，合肥 230601)

镉(cadmium，Cd)可从细胞、组织、器官等层面对生物体产生毒害作用[1-4]。含镉废水处理方法如沉淀法、蒸发法、氧化法、萃取法等在处理低浓度含镉废水时存在费用高、易产生二次污染等缺点[5-7]。生物处理法因能有效避免类似问题而备受关注[8]。

近年来，国内外学者开展了固定化微生物技术处理含镉废水的研究。例如在Cd2+浓度为120 mg/L的条件下，利用海藻酸钠固定化酵母菌处理含镉废水，去除率为80.45%，较游离态酵母菌吸附Cd2+提高了12.5%[9]。以改性的Fe3O4结合海藻酸钠对Bacillusnealsonii固定化，对Cd2+的去除率达96%，并可循环使用[10]。固定化啤酒废酵母在不同吸附时间、pH、Cd2+初始浓度等因素下对Cd2+的去除率为79.82%，且微生物流失少，对环境无二次污染[11]。然而，能高效吸附废水中Cd2+的微生物及其固定化生物吸附剂鲜有报道[12]。植物内生菌为一类对植物生长无害的细菌、真菌或放线菌[13]，对重金属具有较强的耐受性，目前主要是将其与各种植物联合修复受重金属污染的水体、土壤等，是一类在吸附重金属方面很有应用潜力的微生物[10]。

本文通过从芦苇根际组织中分离植物内生细菌ChryseobacteriumrhizosphaeraeSH-1，探究其对Cd2+的耐受性；经海藻酸钠固定化制成生物吸附剂，研究pH、溶液起始金属离子浓度等因素对镉吸附的影响，并采用动力学方法对结果进行分析，以期为含镉废水的处理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株分离与鉴定

内生细菌的培养采用LB固体培养基，其成分为蛋白胨 10.0 g，酵母粉 5.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉 16.0 g，pH 7.0，去离子水补至1000 mL，1×105Pa，灭菌20 min。Cd2+储备液的配置：5 g CdCl2溶解到50 mL去离子水中，0.22 μm滤膜过滤灭菌，-20 ℃保存。实验用水均由Milli-Q提供，所需Cd2+浓度从该储备液稀释。

内生菌的分离：清洗芦苇根部，75%(体积比)的无水乙醇浸泡1 min后转至5%的次氯酸钠中消毒，用无菌水冲洗。取100 μL无菌水涂布于LB平板中培养48 h，若无细菌生长则消毒成功，否则重新消毒。无菌条件下研磨芦苇根部，将研磨液逐级进行10倍系列(10-1～10-8)稀释，取100 μL研磨液涂布，30 ℃培养1～2 d后挑取单菌落，多次划线，将菌液与40%(体积比)的甘油以体积比1∶1的比例混合后于-20 ℃条件下保存。

为提取菌株的DNA，以16S rRNA基因通用合成引物27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增[14]。PCR反应体系(15 μL)为：ddH2O 9.95 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 1.2 μL，27F 0.6 μL，1492R 0.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.15 μL和模板 DNA 1 μL。PCR扩增程序: 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s，20个循环；72 ℃延伸1 min，72 ℃终延伸10 min,4 ℃保存。由上海生工生物有限公司完成测序，结果提交GenBank，进行BLAST比对分析[15]。

1.2 Cd2+对菌株的最小抑菌浓度(MIC)测定

将不同浓度的Cd2+加入LB中并混匀，倒平板。以不添加任何重金属的LB平板作为对照，挑取处于对数生长期的菌株于不同Cd2+浓度的培养基中划线，30 ℃培养3 d，若培养基中无单菌落出现，则可判定该浓度为最小抑菌浓度。

1.3 菌株的形态学分析

采用S-4800场发射扫描电子显微镜(Hitachi，日本)在工作电压3 kV 下观察菌株吸附Cd2+前后的微观结构，其中将未吸附Cd2+的菌株作为对照组；使用VERTEX 80/80v FTIR 型傅立叶红外光谱仪在 4000～400 cm-1内扫描菌株吸附Cd2+前后变化。

1.4 内生菌固定化

将菌株接种到LB固体培养基中，30 ℃培养48 h，3次分离纯化，挑取单菌落接种于液体LB中，30 ℃，150 r/min培养48 h后 10 000 r/min，10 min，弃上清，用无菌水洗涤，离心得湿菌体，将其以5%体积比与4%的海藻酸钠混匀。将混合液倒入20 mL的注射器内，匀速滴入0.3 mol/L CaCl2溶液中，注射器头与液面的距离保持在20 cm左右，至形成4 mm的固定化凝胶小球，搅拌1 h，用无菌水冲洗凝胶小球表面3次，于4 ℃保存作为实验组备用。不添加菌体，按上述同样方法制备空白小球作为对照组。

1.5 Cd2+吸附实验设计

探究时间、pH值、Cd2+初始浓度对固定化微生物吸附Cd2+的影响。分别加入固定化SH-1小球(实验组)和海藻酸钠小球(对照组，干重0.022 g)于相同规格的锥形瓶中，在30 ℃，200 r/min条件下于不同时间间隔(15、30、60、120、240、360、480和600 min)取样；相同条件下用1 mol/L HCI和1 mol/L NaOH调节溶液pH为2、3、4、5、6和7，于480 min时取样；其他因素不变，Cd2+初始浓度调为100、200、300、400、500和600 mg/L，pH 5，于480 min时取样。上清液经0.22 μm的滤膜过滤，使用ICP (iCAP 7400 Duo) 测定Cd2+浓度。每组实验设置3组平行，结果取其平均值。

1.5.1 Cd2+吸附模型

以单位小球吸附率和吸附量表征Cd2+的吸附效率，计算公式如下[16]：

(1)

(2)

式中：a为单位小球吸附率；C0为重金属离子起始浓度(mg/L)；qe为单位小球吸附量(mg/g)；Ce为吸附平衡后重金属离子浓度(mg/L)；Vt为溶液的总体积(L)；M为吸附剂的干重(g)。采用准一级吸附动力学(式3)和准二级吸附动力学模型(式4)描述固体吸附剂与液相吸附质的动力学关系[17]。

式中：qe为平衡吸附量(mg/g)；qt为t时刻吸附量(mg/g)；k1为准一级动力学速率常数；k2为准二级动力学速率常数。通过Langmuir(式5)和Freundlich模型(式6)来拟合固定化微生物的物理吸附和化学吸附过程[18]。

(3)

(4)

(5)

(6)

式中：qmax为单分子层饱和时的吸附容量(mg/g)；KL为Langmuir常数；qe为平衡吸附量(mg/g)；KF为异相吸附剂的Freundlich常数；Ce为金属离子初始浓度(mg/L)；n为与吸附位能量分布相关的Freundlich常数。

1.5.2 固定化小球解吸附实验

为了探究固定化小球的重复利用率，本实验用0.1 mol/L HCl对小球进行解吸附研究。将吸附后的小球用ddH2O冲洗后，250 r/min解吸2 h，通过0.22 μm的滤膜过滤取上清，用ICP测溶液中的Cd2+浓度，并计算解吸率。每次实验的小球用ddH2O重悬于4 ℃保存，待下次使用。

(7)

式中:mdes为解吸附Cd2+的量(mg/g)；mads为吸附Cd2+的量(mg/g)。

1.6 实际废水应用

从校园内某教学楼一楼废水排放口采集一定量废水，按照2.5中探讨的固定化菌株吸附Cd2+的最佳条件，在30 ℃，200 r/min条件下培养，随时间测定废水中剩余Cd2+浓度。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

将菌株的16S rRNA序列与数据库中的序列进行BLAST比对，由菌株的系统发育树(图1)分析可知菌株与ChryseobacteriumrhizosphaeraeRSB3-1T的同源性为99.3%，将得到的基因序列提交到GenBank，得登录号为MH014969, 长度为1480 bp的基因序列，因此确定该菌株为根际金黄杆菌属，命名为SH-1。

图1 SH-1 系统发育树分析

2.2 Cd2+对菌株的MIC测定

如表1所示，菌株SH-1对Cd2+表现出很强的抗性。对该菌株在不同浓度重金属离子的固体培养基中生长情况可知，其最小抑菌浓度(MIC)值为450 mg/L，表明菌株对重金属Cd的高抗性预示着它在实际应用中有很大的潜力。

2.3 菌株吸附Cd2+的形态学分析

菌株SH-1(图2-a)为杆状，无荚膜，且表面光滑饱满。添加100 mg/L的Cd2+(图2-b)后，菌株表面附有白色颗粒，与李学龙等[19]研究结果相比，进而推测出细胞表面可能有特定的结构吸附金属，且在Cd2+胁迫下，菌株SH-1通过产生该结构去除Cd2+带来的不利影响。

表1 菌株SH-1最小抑菌浓度测定结果

注： “+++”良好抗性；“++”较好抗性；“+-”有抗性，但生长不好，“-”无抗性

a: 对照组(标尺1 μm)；b: 100 mg/L Cd2+(标尺 1 μm)

图2SH-1吸附Cd2+前后扫描电镜图

Figure 2 SEM of SH-1

图3 SH-1吸附Cd2+ FTIR光谱分析

傅里叶红外(FTIR)分析(图3)显示菌株SH-1未吸附Cd2+前(a曲线)在3290 cm-1处具有强而宽的特征吸收峰，为典型的羟基吸收带，这是由O-H的伸缩振动和N-H的伸缩振动发生耦合作用而增宽的吸收峰；2923 cm-1处的吸收峰是由C-H的伸缩振动造成的；2131 cm-1处有N≡C-吸收峰；1645 cm-1处出现尖而短的蛋白质酰胺I带吸收峰；1548 cm-1处吸收峰是由-NO2的振动引起的；1242 cm-1处的吸收峰主要由C=S 和 P=O 键的伸缩振动引起的；1082 cm-1处的吸收峰是S-O反对称伸缩振动形成的吸收峰；菌株SH-1吸附Cd2+后的光谱图较吸附前峰形基本保持不变。3290、2923、2131、1645、1548、1242、1082 cm-1处的吸收峰分别移动到3296、2925、2119、1656、1546、1240、1080 cm-1处，菌株吸附Cd2+后(b曲线)3290、2923、1645 cm-1处的吸收强度增加，刘杨眉等[20]认为这可能是在吸附Cd2+后，菌株本身的结构未破坏，也无新的物质生成，而O-H、N-H、C-H、N≡C-、-NO2、C=S、P=O、S-O等基团可能参与了吸附作用。

2.4 不同因素对固定化SH-1吸附Cd2+的影响

由图4可知，实验组在前30 min吸附Cd2+速度快，30 min后速度变缓，480 min后达到平衡，此时吸附量为50.6385 mg/g，而对照组吸附量仅为46.9303 mg/g。

图4 吸附时间对固定化微生物吸附的影响

由图5所示，当溶液pH值由2增加到5时，实验组对Cd2+的吸附量和去除率逐渐增加，pH值由5增加到7时，吸附量和去除率则逐渐降低。由此可知，最适pH值为5。当pH值为5时，其对Cd2+的吸附量为55.238 mg/g，去除率为93.24%；对照组小球则分别为49.327 mg/g和85.14%，据文晓凤等[10]的研究可知，这可能是由于固定化微生物小球表面、孔隙均可供内生菌SH-1附着，且SH-1细胞表面的羟基能螯合转化吸附Cd2+，并对Cd2+有着一定的吸附、转化作用。

由图6可知，当Cd2+初始浓度为100 mg/L时，固定化SH-1小球对Cd2+的吸附量和去除率分别为51.485 mg/g、87.56%，而对照组小球则分别为43.667 mg/g、74.264%。当Cd2+初始浓度大于100 mg/L，SH-1小球对Cd2+的去除率逐渐下降。这与陈亚奎[21]的研究结果相一致，即随着Cd2+的浓度增加，固定化小球表面的吸附官能团与Cd2+的结合量增大，从而对其去除率降低。

综上，当反应时间为480 min，pH值为5，起始浓度为100 mg/L时，固定化SH-1小球对Cd2+的吸附率最佳，效率达93.24%，高于相关的文献报道[22]。以上结果通过t检验法证明且得出P<0.05，进而说明实验组小球相比对照组小球对Cd2+的吸附效率有显著提高。

图5 pH值对固定化微生物吸附的影响

图6 Cd2+初始浓度对固定化微生物吸附的影响

2.5 固定化SH-1吸附模型

采用Langmuir和Freundlich吸附模型对Cd2+的吸附过程进行线性拟合，结果如图7-a、 b，拟合的相关参数计算见表1。固定化SH-1小球的Langmuir相关系数比Freundlich方程要高，超过了0.99。因此，Langmuir方程能更好地拟合其吸附Cd2+的过程，表明其吸附过程主要为单分子吸附。

表2 固定化微生物吸附Cd2+等温参数

动力学模型分别如图7-c、 d，相关参数见表2。由表2可知，其准二级动力学系数高于准一级动力学。说明准二级动力学能更好地描述Cd2+的吸附过程，也就是化学键的形成对吸附起着重要的作用。从表2和表3看出，实验组小球的最大吸附量比对照组小球的高；进而说明实验组小球吸附Cd2+的能力要高于对照组小球。

图7 固定化SH-1小球吸附Cd2+等温模型和动力学模型

2.6 固定化小球解吸附实验

此外，图8表明在3次循环之后，对照组和实验组对Cd2+的平均解吸附率分别为88.45%和95.15%；进一步说明固定化SH-1小球可高效反复地吸附水溶液中的Cd2+，能有效地循环利用；且实验组小球的解吸附能力要远高于对照组小球，实验结果与文晓凤等[10]结果一致。

2.7 实际废水应用

图9描述了固定化小球对废水中Cd2+的吸附情况。结果表明，在反应时间为480 min时，对照组和实验组对Cd2+的去除率分别为75.41%和85.95%，说固定化小球能有效去除实际废水中Cd2+，但去除率和吸附量均低于实验数值，这可能是由于实际废水中成分复杂，含有其他物质竞争吸附，进而影响吸附结果，该结果表明固定化SH-1小球在去除实际工业废水中Cd2+具有潜在的可能性。