CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼kctd1纯合突变体的构建

刘 姣, 黄 姣, 胡金萌, 李伟明, 任建峰

(1. 海洋生物科学国际联合研究中心(上海海洋大学)中国科学技术部， 上海 201306；2. 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室(上海海洋大学)， 上海 201306；3. 水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)， 上海 201306)

人体中包含26个钾离子通道四聚体蛋白(potassium channel tetramerization domain, KCTD)，该家族成员均含有序列相似的钾离子电压门控(voltage-gated K+channels, Kv channels)的细胞质结构域[1-2]。KCTD蛋白在N端具有保守的BTB(Bric-a-brack,Tram-track, Broad complex, BTB)结构域，也称为POZ(poxvirus and zinc finger)结构域，但是却具有多变的C端。含有BTB结构域的蛋白通过该结构域介导蛋白互作，其功能包括转录抑制、细胞骨架调节、离子通道的四聚体化、与泛素化连接酶E3(Cul3)相互作用等[3-7]。KCTD蛋白参与多种信号通路，包括Shh信号通路、Wnt/β-catenin信号通路和GABA信号通路等[2,8-15]。KCTD蛋白在增殖、分化、凋亡和新陈代谢等方面具有重要的调控作用，研究表明KCTD基因表达异常导致人类疾病的发生，如乳腺癌、髓母细胞瘤和肥胖等[2,6-19]，但该家族绝大多数成员的具体功能还不清楚。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9 )系统是继锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease, ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)之后的第3代人工核酸内切酶，可以实现特定基因的高效编辑[20-22]。

斑马鱼(Daniorerio)具有生殖周期短、胚胎透明和产卵量大等优点，已成为研究器官发育以及疾病模型构建等研究的模式生物[23]。KCTD1突变导致人类表皮-耳朵-乳头综合征(Scalp-ear-nipple syndrome, SEN)，其临床表现包括头皮表皮发育不全，没有乳头，耳朵畸形等[24]。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼kctd1基因突变体，并对kctd1在斑马鱼多个组织的表达水平进行定量分析，以期为进一步研究kctd1基因功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

野生型斑马鱼AB品系购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，zCas9 质粒由北京大学生命科学学院张博教授实验室惠赠，pUC19-scaffold 质粒由北京大学分子医学研究所熊敬维教授实验室惠赠；DH5α 菌株购自天根生化科技(北京)有限公司；Cas9体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINETM®T7 Ultra Kit(AM1345)和gRNA体外转录试剂盒MAXIscript®T7inVitroTranscription Kit(AM1314)购自Ambion公司；DNA纯化试剂盒DNA Clean & ConcentratorTM-5 (D4014)购自Zymo Research公司；Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(M0531L)和T7 Endonuclease I(M0302L)购自NEB公司；2×EasyTaq®PCR SuperMix for PAGE(AS112)购自北京全式金生物技术有限公司；TRIzol(15596-018)购自Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)购自Takara公司；LightCycler®480 SYBR Green I Master(Roche, 04887352001)和LightCycler®480II(Roche)实时荧光定量PCR系统均购自罗氏公司。

1.2 靶点及检测引物的设计

在 Ensembl 网站(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)上查找目的基因序列，在zifit网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计一段20 bp大小的靶序列，在网站http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Tools/Blast?db=core上对靶序列进行BLAST比对，验证靶点特异性。gRNA 体外转录模板的上游引物如下： 5′-TAATACGACTCACTATAGCAGCCTGGCCACATTAACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′；下游引物如下：5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′。

在斑马鱼kctd1多个转录本共有区域即基因的第3个外显子上设计靶点(图1)。

注：红色碱基代表Cas9蛋白识别的PAM(protospacer adjacent motif)位点

图1靶点设计示意图

Figure 1 Diagram of target site design

本实验采用T7E1核酸内切酶酶切检测的方法进行突变体的筛选。该酶能够识别并切割不完全配对的DNA Holliday 结构或交叉DNA等。设计的引物需要符合以下原则：上下游引物距离靶位点两侧距离都大于 100 bp，两个引物到靶点的距离差至少大于50 bp，PCR扩增产物大小范围在300 bp至500 bp之间，且条带单一。通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计合适的引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，表1为所列引物序列信息。

表1 靶点及检测用的引物序列信息

1.3 gRNA和Cas9 mRNA合成

gRNA合成。合成模板的准备：高保真酶PCR反应体系包括12.5 μL Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix，9.5 μL RNase-free H2O，1.0 μL(50 ng/μL)gRNA 质粒， 1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物。反应程序：98 ℃ 预变性30 s；98 ℃ 变性10 s，65 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸50 s，共34个循环；72 ℃ 再延伸5 min。gRNA体外转录：按照试剂盒步骤进行RNA合成。

Cas9 mRNA合成。合成模板准备：X-baⅠ酶切体系包括1.0 μL Restriction Enzyme，1.0 μg Cas9 plasimid，5.0 μL 10×NEB Buffer，X μL RNase free H2O，反应总体积50.0 μL。反应程序是37 ℃ 20 min。Cas9 mRNA体外转录：按照试剂盒步骤进行RNA合成。

1.4 显微注射及敲除检测

在斑马鱼胚胎一细胞期进行注射，注射体系为Cas9 mRNA∶gRNA=400 ng/μL∶100 ng/μL，注射剂量V=1 nL。注射完成后，将胚胎置于28.5 ℃培养箱中进行培养，并定期换水。

取注射后2 dpf的胚胎(5枚/管，3管)，向每管样品中加入50 μL 50 mmol/L NaOH，95 ℃ 加热10 min，振荡；重复加热振荡；加入5 μL pH 8.0 1 mol/L Tris-HCl，10 000 r/min，离心5 min，上清即为基因组。根据表1所列引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系包括2.0 μL DNA模板，1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物，8.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×EasyTaq®PCR SuperMix for PAGE。PCR反应程序：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，共34个循环;72 ℃ 再延伸5 min。将PCR产物进行T7E1酶切检测，将酶切成功的PCR产物送生工测序，若敲除成功，靶点附近及以后出现套峰。

1.5 F0斑马鱼生殖细胞对突变的遗传性检测

将敲除成功的F0胚胎饲养至性成熟，与显微注射时留作对照的野生型成鱼外交，收集发育2 dpf的胚胎(5枚/管，3管)，提取基因组后PCR扩增，T7E1酶切及测序检测靶位点突变情况，将 T7E1 酶切成功的PCR产物进行测序，并将有突变对应的F1胚胎养起来。

1.6 F1成年斑马鱼基因型鉴定

对54尾F1成年斑马鱼剪尾提取基因组，通过T7E1酶切及测序检测，将酶切成功的PCR产物纯化后进行TA克隆，每条F1挑选PCR产物的5个TA单克隆进行测序确定突变类型。

1.7 F2纯合突变体的筛选

将获得的两种突变类型为+7 bp和-8 bp的F1杂合体成鱼分别内交，分别得到41尾和72尾F2。对F2成鱼剪尾提取基因组，PCR产物进行T7E1酶切检测，PCR产物切开对应的个体为杂合子；未切开对应的个体为WT或纯合子，通过PCR产物测序及序列比对，确定F2基因型。

1.8 qRT-PCR检测kctd1组织表达情况

用TRIzol法提取WT成鱼的心脏、肝脏、皮肤、脑和鳃5个组织的总RNA，每个组织3个生物学重复。使用试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行RNA反转录获得cDNA。在NCBI网站设计kctd1 qRT-PCR引物(表2)，使用罗氏SYBR和罗氏LightCycler®480II 实时荧光定量PCR系统进行荧光定量检测，使用2-ΔΔct法计算基因相对表达量，使用软件Graphpad prism5绘制柱状图。

表2 qRT-PCR 引物序列

红框代表PAM和靶序列，黑色箭头代表Cas9切割位置

图2kctd1注射敲除后T7E1酶切检测和测序分析

Figure 2 T7E1 assay and sequencing analysis ofkctd1 knock-out after injection

2 结果与分析

2.1 F0显微注射敲除检测

经过T7E1酶切检测，根据公式100×{1-sqrt[1-(b+c)/(a+b+c)]}计算敲除效率，a为未切开条带灰度值，b、c为切开条带的灰度值[26]。得出kctd1显微注射的敲除效率范围是11.60%～37.41%，将酶切成功对应的PCR产物进行测序，发现在靶点附近及以后出现乱峰，说明敲除成功(图2)。

2.2 F1突变类型检测

通过F1成鱼剪尾及PCR产物TA克隆检测，成功获得kctd1两种突变类型，为+7 bp和-8 bp(图3)。

2.3 F2纯合突变体的筛选

经过序列比对，得到F2两种突变类型的纯合突变体-8 bp-/-18尾，+7 bp-/-11尾，F2具体基因型统计情况如表3所示。

红框代表靶序列，红色箭头代表Cas9切割位置

图3 F1突变类型检测

2.4 kctd1组织表达检测

TRIzol法提取WT成鱼心脏、肝脏、皮肤、鳃和脑组织RNA，qRT-PCR检测kctd1基因的组织表达情况。定量结果显示，相较于心脏、肝脏、皮肤和鳃组织，kctd1在脑组织中显著高表达(图4)。

***表示P<0.001

图4野生型斑马鱼中kctd1组织表达分析

Figure 4 Expression ofkctd1 in WT zebrafish

3 讨论与结论

CRISPR/Cas9作为第3代人工核酸内切酶，能够实现单基因以及多基因的敲除，与TALEN、ZFN相比操作更加简便。斑马鱼基因组与人类基因组具有很高的相似性，已经成为研究器官发育与疾病模型构建的理想模型。这些都大大提高了我们利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼kctd1基因突变体的可行性[20-23]。

KCTD家族在进化上具有保守性。有研究报道，KCTD1能够与细胞朊蛋白(cellular prion protein，PrPC)相互作用，而且能够抑制AP2α的转录活性[28-29]。人类中，KCTD1基因的突变则会导致头皮-耳朵-乳头综合征，与TFAP2A异常导致的觸裂眼面综合征(Branchio-oculo-facial syndrome, BOFS)具有相似的临床表型，表明SEN和BOFS的发病机制可能具有相似性[24, 30]。人类KCTD1基因在乳腺、肾、脑和卵巢中表达，亚细胞定位显示KCTD1属于核蛋白[19]。我们的定量分析结果显示，斑马鱼kctd1基因在野生型成鱼脑组织中显著高表达，对进一步研究kctd1基因功能有一定的参考价值。Kumar等用ENU构建了小鼠Kctd1突变体，即Kctd1I27N，杂合突变体表现出肾功能衰竭，纯合突变体在围产期死亡[27]。我们用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼kctd1纯和突变体，但是尚未发现明显的表型，一方面可能是该基因在鱼类和人类中功能有所差别，另一方面可能是因为斑马鱼中kctd基因家族其它成员基因补偿效应造成的，需要进一步研究。

目前，关于斑马鱼kctd基因突变体方面的研究很少。Tong等研究报道发现一尾斑马鱼kctd10的自发突变体，并利用TALEN技术重新构建了斑马鱼kctd10突变体，研究结果表明，Kctd10通过抑制Tbx5a转录活性调控斑马鱼心脏的形态发生[31]。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼kctd1基因突变体，显微注射后检测突变效率为11.60%～37.41%，最终筛选获得可稳定遗传的插入缺失纯和突变体(+7 bp-/-和-8 bp-/-)。斑马鱼kctd1基因突变体的构建，为进一步研究kctd1基因功能提供了基础；同时，斑马鱼研究结果将对人类KCTD1基因功能以及KCTD1致病机制的研究具有参考价值。