uPAR在肿瘤诊断与治疗中的研究进展

韩倩倩， 周 琴， 张兰兰， 吴朋飞， 马腾飞， 马冰冰， 徐昌志， 张部昌

(1.安徽大学 物质科学与信息技术研究院， 合肥 230601; 2.安徽天祥粮油食品有限公司， 阜阳 236300)

恶性肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌等严重威胁人类健康，患者病死率较高，且发病率也呈逐年上升趋势。早期诊断和治疗是防治肿瘤的一个关键环节。目前常规的肿瘤诊断方法是X射线、计算机断层扫描技术等影像学诊断方法，然而该方法灵敏度和特异性有限，同时可能出现影像学诊断的假阳性[1]。因此，寻找特异性的肿瘤基因标志物，将其与探针偶联，应用放射免疫显像技术进行诊断，提高肿瘤诊断的灵敏度和特异性，实现肿瘤细胞的定位及定量检测已成为新的研究方向。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)，又称CD87，是富含半胱氨酸的单链糖蛋白，由三个结构域D1、D2和D3区组成，没有跨膜区和胞内结构域，主要通过C-末端糖基磷脂酰肌醇锚定到细胞膜表面[2]。uPAR通常只在少数正常细胞如子宫、胸腺、肾脏及脾脏中的巨噬细胞和粒细胞中低表达[3]，但在肿瘤细胞如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等中均存在过表达现象[4]。研究表明uPAR与肿瘤的增殖、迁移及预后密切相关。uPAR与uPA(urokinase-type plasminogen activator)特异性结合，能增强纤溶酶原的激活，加速细胞外基质的降解，促进细胞迁移[5]。uPAR与整联蛋白、玻连蛋白等不同类型的跨膜受体相互作用，促进细胞内信号分子如黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)和蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB)介导的下游信号转导，增加癌细胞的存活率及对凋亡的抗性[6]。同时，uPAR表达量升高与患者的不良预后有关[7-8]。因此，uPAR被确定为抗癌治疗的理想靶标[9]。已有多个实验室将靶向uPAR的小分子AE105及抗体ATN-658与放射性核素进行偶联，利用PET成像技术来实现对肿瘤细胞的定位及定量检测[10-12]。同时在以uPAR为靶点抑制肿瘤方面的研究也得到较快发展。以下主要介绍uPAR在肿瘤诊断及治疗中的研究进展。

1 基于uPAR的肿瘤成像剂的开发

uPAR在癌症进展中发挥至关重要的作用，已有多个实验室在开发靶向uPAR的肿瘤诊断方式上做出努力，其中一个重要的方法是开发非侵入性诊断/成像剂。目前靶向uPAR的成像技术已用于多种类型的癌症中[12]。

1.1 基于靶向uPAR的小分子PET成像

AE105是由9个氨基酸组成的智能肽，能够高特异性地结合uPAR，主要用于手术时术中指导以及转移评估[13]。目前已经开发出基于AE105的PET成像探针，并且在患者体内检测uPAR时显示出良好的效果[11, 14-17]。Persson等制备了64Cu-DOTA-AE105探针，首次证明在U87MG肿瘤移植小鼠中肿瘤对探针的摄取率与uPAR表达水平之间存在定量关系[11]。考虑到DOTA/64Cu在体内的不稳定性，Ploug等[2]设计了两种跨桥环式螯合剂：CB-TE2A和CB-TE2A-PA，将其与AE105进行偶联用于靶向uPAR的PET成像。64Cu-CB-TE2A-PA-AE105在体内的稳定性、肿瘤背景对比度和肿瘤摄取量上均优于64CU-CB-TE2A-AE105[14]。正电子发射体68Ga的物理半衰期达到68 min，这与低分子量放射性药物，如肽、适配体及小分子的药代动力学参数相匹配，因此引起人们的极大兴趣[15]。68Ga与NOTA-AE105能直接进行放射性标记，标记物68Ga-NOTA-AE105在体内具有很高的图像对比度，能清晰地观察到肿瘤的位置及轮廓[16]。在小鼠模型中68Ga-NOTA-AE105的肿瘤与背景比显著高于O-(2-[18F]氟乙基)-L-酪氨酸(7.6±2.1vs1.8±0.3)，但肿瘤绝对摄取率非常低(0.4±0.1% ID/g)。为解决上述问题，Sun等设计了一个新型的68Ga标记的AE105示踪剂，即在AE105与放射性金属螯合剂之间插入聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)以优化其成像性质。体内的PET成像显示在注射示踪剂1 h后68Ga-NODAGA-PEG8-AE105的肿瘤摄取率比68Ga-NODAGA-AE105高两倍以上。此外，体外的生物分布检测也证实了PEG修饰的示踪剂能够提高肿瘤的摄取率[17]。因此，68Ga-NODAGA-PEG8-AE105能够很好地应用于靶向uPAR的PET成像中。

最近在乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌患者中AE105的1期临床试验已经完成。该研究将AE105与有机环状螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10四乙酸(DOTA)缀合，然后用64Cu标记用于PET成像，发现该试剂对于癌症患者具有良好的生物分布及稳定性[13]。

1.2 基于靶向uPAR的抗体PET成像

AE105作为小分子肽，半衰期短，其成像时间通常在几个小时内[18]。为了改善示踪剂的效果，人们早在十几年前就开发出了基于靶向uPAR的抗体成像探针。如2002年，Rabbani等[19]利用乳腺癌和前列腺癌的啮齿动物模型，发现uPAR是癌症诊断的可成像目标。该实验将125I标记的抗鼠uPAR抗体注射到患有前列腺癌和乳腺癌的动物中，发现在原发性肿瘤以及一些常见的转移部位包括肝、肺、脾和淋巴结中放射性标记物的摄取量很高，而在对照动物中摄取量非常低。这表明uPAR可以作为癌症进展和转移的诊断/成像目标[19]。此后，科研人员又做了大量研究来挖掘和验证uPAR在不同类型癌症中的诊断潜力。其中，较为关注的是靶向uPAR的人源化抗体ATN-658，ATN-658与uPAR的D3区具有高亲和力(Kd≈1 nmol/L)，同时它只与人uPAR特异性结合，而与鼠uPAR不会发生交叉反应。在人癌异种移植模型中，ATN-658能够抑制uPAR阳性肿瘤的侵袭、迁移、生长和转移[20]。此外，ATN-658可与示踪剂如荧光探针偶联，靶向作用于肿瘤组织，利用PET成像技术实现对肿瘤细胞的定位及定量检测[18]。目前，ATN-658已用于癌症诊断的多模型成像中。

AE105和ATN-658都能用于肿瘤的诊断，但它们所表现的成像时间不同。AE105分子量低，半衰期短，成像时间通常只有几个小时[18]。而ATN-658在血清中具有更长的半衰期，这使得其成像时间可以延长至数天[18]。AE105是uPA与uPAR结合的竞争性抑制剂[21]，而ATN-658与uPAR的结合位点与uPA不同，其抗肿瘤活性与uPA-uPAR相互作用无关[22]。ATN-658主要通过抑制整合素与uPAR的相互作用来抑制下游信号通路活化[22]。当uPA与uPAR结合时，AE105不能特异性靶向uPAR，因此基于AE105的探针靶向肿瘤的成像强度将取决于uPA与uPAR的饱和度。而ATN-658与uPAR的结合不受uPA的影响，所以其成像强度更能准确反映肿瘤中uPAR的表达量[21]。

2 uPAR在肿瘤靶向治疗中的作用

2.1 Å6抑制uPA/uPAR的相互作用

早期研究证实uPA/uPAR相互作用的非竞争性拮抗剂Å6可抑制体内肿瘤的生长和转移[23]。在胶质母细胞瘤的异种移植模型中，顺铂与Å6联用在抗肿瘤和抗血管生成方面显示出更强的效果[23]。最近，Kanno等证实Å6通过中止uPA与uPAR的相互作用来抑制脂多糖介导的炎性破骨细胞的生成，为炎性骨病的治疗提供依据[24]。这些研究结果加速了在不同类型癌症中使用Å6的临床评估进程，Å6的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验显示出较好的疗效性和安全性[25-26]。

2.2 靶向uPAR的抗体

在精准医学时代，针对肿瘤的特异性抗体已经显示出很好的应用价值。目前已研制出许多靶向uPAR的抗体来阻断其与uPA或整联蛋白的相互作用[27-28]。Van Buren等证实靶向uPAR的单克隆抗体ATN-658在体外能够明显抑制结肠癌细胞的迁移，同时在体内显著抑制肿瘤的生长[27]。Rabbani等证明ATN-658能够阻断前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移[28]。此外，它在多种癌症中显示出抗癌活性。以上结果显示ATN-658在临床试验中用于治疗癌症方面有良好的前景。

2.3 抑制uPAR蛋白表达

抑制或干扰uPAR蛋白质合成的方法主要是利用核酶、反义寡核苷酸抑制物、RNA干扰(RNA interference， RNAi)等。在体外人骨肉瘤细胞中，靶向uPAR mRNA的核酶能阻断mRNA翻译，进而抑制癌细胞的增殖及迁移等[29]。Lulli等利用反义寡核苷酸靶向uPAR，在降低人视网膜内皮细胞中的uPAR mRNA及蛋白水平、阻断血管内皮生长因子诱导的促血管生成以及减少视网膜病变小鼠中的新血管形成方面具有高效性，为治疗增值性视网膜病变提供基础[30]。在三阴性乳腺癌中，RNAi靶向uPAR能够增加死亡受体4(death receptor 4，DR4)及死亡受体5(death receptor 5，DR5)的表达，进而触发癌细胞的凋亡[31]。Gao等证明在口腔舌鳞状细胞癌中，RNAi沉默uPAR能够抑制口腔舌癌细胞的侵袭和迁移等[32]。因此，抑制uPAR蛋白的表达能够抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭及抗凋亡能力等。

2.4 纳米蛋白与抗uPAR抗体联合使用

纳米蛋白是由更精确靶向肿瘤组织的脂质体纳米颗粒药物包裹的物质[33]，其主要优势包括增加循环半衰期，减少脱靶效应，同时能够特异性地将治疗药物输送到肿瘤细胞中。纳米蛋白可以很容易地与特异性抗体结合以增强高特异性抗体靶向癌细胞的细胞毒性[34]。例如，Zhang等将靶向uPA抗体与脂质体纳米蛋白偶联，利用电感耦合等离子体光学质谱(inductively coupled plasma optical mass spectrometry， ICP-MS)和荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)技术证实卵巢癌细胞对与抗体偶联的纳米蛋白的吸收量提高4倍以上。同时，抗体偶联纳米蛋白在体内和体外能更加有效地抑制肿瘤细胞生长，诱导半胱天冬酶介导的细胞凋亡并抑制干细胞标记物醛脱氢酶-1A1的表达[34]。

3 结语

uPAR在癌症的不同阶段具有多效性，在许多恶性肿瘤中特异性高表达，进一步的机制研究确定其与肿瘤生长增殖和转移扩散相关。研究表明，基于靶向uPAR的小分子药物AE105和抗体ATN-658的PET成像技术能够实现肿瘤细胞的定位及定量检测，以提高肿瘤的早期诊断及鉴别能力，降低患者的死亡率。在靶向uPAR的肿瘤治疗中，抑制uPA与uPAR的相互作用、抑制uPAR蛋白的表达、靶向uPAR的抗体等方法均能达到抗癌作用。未来，可以开发更多靶向uPAR治疗的新型药物以用于多种恶性肿瘤的诊断及治疗中，例如将抗uPAR抗体与其他靶点抗体结合，构建双特异性抗体，以提高治疗效果和靶向检测的特异性等。这些研究有望为患者提供更好的诊断和治疗选择，以改善相关癌症的治疗效果。