多囊卵巢综合征患者卵丘颗粒细胞中特异性环状RNA的表达研究

马志，赵慧珊，张妍，刘晓妍，郝翠芳*

(1.青岛大学医学部，青岛 266071；2.青岛大学附属烟台毓璜顶医院生殖医学中心，烟台 264000；3.中科院动物研究所，北京 100101)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女最常见的内分泌疾病，具有较大异质性。根据不同的诊断标准和人群统计，其发病率介于6%～8%(NIH标准)至20%(鹿特丹标准)之间[1-2]。在无排卵性不孕患者中，约有75%被诊断为PCOS[3]。罹患PCOS的女性会出现全身多个系统的短期和长期并发症，包括生殖(多毛、闭经、无排卵、不孕和妊娠合并症)、代谢(2型糖尿病、心血管系统疾病和脂质代谢异常)和精神(消极、焦虑)等方面[4]。目前针对PCOS的治疗也多为对症处理，尚无法完全治愈。

环状RNA(Circular RNA，circRNA)现多认为是非编码RNA的一种，因其呈闭合环状结构，缺少5’帽端和3’ poly A尾而得名。近几年研究发现，circRNA普遍存在于多种真核生物中，可抵御RNA酶R的降解，表达呈现出组织和时序特异性[5]。研究发现circRNA通过“吸附”microRNA(miRNA)、调节可变剪接和亲本基因表达，广泛参与到各类疾病的发生发展，包括肿瘤、子痫前期，心血管和神经系统疾病[6-9]等方面，但在PCOS中尚未见报道。本研究通过芯片检测及后续实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证PCOS患者卵丘颗粒细胞中特异性circRNA的表达，并对circRNA表达水平和患者临床特征资料进行关联分析，为进一步探索PCOS发病机制和诊疗方法提供了新的思路。

资料与方法

一、研究对象

1.患者来源：收集2017年5～12月期间于青岛大学附属烟台毓璜顶医院生殖医学科行IVF/ICSI-ET助孕的典型PCOS患者6例，同时选取同时期因男方或者输卵管因素治疗的6例患者为对照组。收集卵丘颗粒细胞，送circRNA芯片检测；芯片结果回报后，另选取同时期的PCOS及卵巢正常对照各25例患者，收集卵丘颗粒细胞进行qRT-PCR验证。

入组标准：PCOS组患者均严格按照鹿特丹标准[10]筛选：稀发排卵或无排卵、卵巢多囊样改变、高雄激素表现或高雄激素血症，满足其中两条及以上，且排除先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征和雄激素分泌性肿瘤等导致雄激素异常升高的疾病；正常对照组患者均因男方或输卵管因素而寻求助孕治疗。排除标准：子宫内膜异位症、甲状腺或内分泌功能异常及全身系统性疾病等情况。所有患者均为第一周期、标准长方案促排卵。

2.主要试剂及仪器：Trizol reagent(Takara，日本)、QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN，德国)、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN，德国)、qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成；NanoDrop 2000分光光度计(ThermoFisher Scientific，美国)、StepOnePlus 实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems，美国)、Human CircRNA Array v2芯片检测平台(北京博奥)。

二、研究方法

1.资料收集：分别收集PCOS(n=25)及正常对照组患者(n=25)临床特征资料进行回顾分析。收集内容包括：年龄，体重指数(BMI)，抗苗勒氏管激素(AMH)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、LH/FSH、雌二醇(E2)、睾酮(T)、孕酮(P)、催乳素(PRL)、抑制素B(INHB)和25-(OH)D3水平，以及促排卵过程中的Gn总用量、获卵数、优质胚胎数和优胚率。

2.卵丘颗粒细胞的收集：HCG扳机后36 h，按照取卵标准穿刺取卵，获得卵母细胞-放射冠-卵丘颗粒细胞复合体(COC)，用1 ml注射器针头仔细机械剥离得到卵丘颗粒细胞，PBS清洗3遍后，冻存于-80℃待提取RNA。

3.总RNA提取及逆转录：依照Takara Trizol regent说明书，采用一步法抽提颗粒细胞总RNA。取1 μl RNA溶液，NanoDrop 2000测定浓度及A260/A280判断纯度。取1 μg总RNA于20 μl体系中，根据QuantiTect Reverse Transcription Kit说明书步骤逆转录为cDNA。

4.CircRNA芯片检测：由北京博奥公司Human CircRNA Array v2芯片平台完成，包含可检测170 340种人circRNA的探针。circRNA靶序列来自Circbase、Deepbase和Rybak-Wolf2015[11]等数据库。

5.qRT-PCR：circRNA具有特殊环状结构，其与同源的mRNA的差异仅在成环的接头处，因此所有引物均针对接头处序列进行扩增。由NCBI的Primer-BLAST设计完成，内参基因选定β-actin，引物序列见表1。将逆转合成的cDNA稀释5倍作为模板，按照QuantiNova SYBR Green PCR Kit说明书操作，具体反应条件如下：95℃预变性2 min，然后按照95℃ 5 s，60℃ 10 s，进行40个循环；记录各组Ct值，采用2-ΔΔCt法计算circRNA相对表达量。每个样本至少3次重复，每次实验重复3遍。

表1 荧光定量PCR引物序列

三、统计学处理

结果

一、患者的一般资料及临床特征

1.circRNA芯片送检样本来源患者：PCOS组患者BMI、AMH、LH、LH/FSH、T均显著高于对照组(P<0.05)；PCOS组获卵数显著高于对照组(P<0.05)；Gn总用量低于对照组，优胚数稍高于对照组，但均无显著性差异(P>0.05)；两组间其他参数比较均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

2.进行qRT-PCR验证患者：PCOS组患者的BMI、AMH、LH、LH/FSH、T和P均显著高于对照组(P<0.05)，FSH显著低于正常对照组(P<0.05)；促排卵过程中PCOS组获卵数显著高于正常对照组(P<0.05)，Gn总用量低于对照组、优胚数稍高于对照组，但均无显著性差异(P>0.05)；两组间年龄、优胚率、E2、PRL、INHB和25-(OH)D3差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

二、circRNA芯片表达谱

从芯片数据聚类图和散点图(图1)可以看出，进行芯片检测的6例PCOS与正常对照患者样本卵丘颗粒细胞circRNA的表达存在显著差异。在286个筛选的差异表达circRNA中，PCOS组上调表达167个，下调表达119个。为进一步验证芯片结果的准确性，我们按差异倍数(Fold Change，FC)>4，P<0.01挑选出3个待测circRNA(表4)，在扩大样本(PCOS与正常对照各25例)中进行qRT-PCR检测。

表2 circRNA芯片样本来源患者的基本临床资料(-±s)

注：本中心优质胚胎指受精第3天，细胞数在6～9，分级为1或2级的胚胎；优胚率=第3天优胚数/2PN胚胎数；与PCOS组比较，*P<0.05；T、P、PRL换算为法定单位分别为(ng/dl×0.034)nmol/L、(ng/ml×3.17)nmol/L、(ng/ml×0.0455)nmol/L

表3 qRT-PCR验证的两组患者一般资料与临床特征(-±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；T、P、PRL换算为法定单位分别为(ng/dl×0.034)nmol/L、(ng/ml×3.17)nmol/L、(ng/ml×0.0455)nmol/L

A：聚类图；B：散点图；红色和绿色分别表示在PCOS组中显著上调和下调的基因；P和N分别代表PCOS组和对照组样本

表4 待测circRNA基本信息

三、待测circRNA在两组患者卵丘颗粒细胞中的表达情况

统计结果显示，PCOS组中hsa_circ_0043533表达量显著高于对照组(P<0.05)，hsa_circ_0097636显著低于对照组(P<0.01)，qRT-PCR结果与芯片结果相一致；而hsa_circ_0020491表达在两组间无显著差异(P>0.05)(图2)。

四、circRNA表达与PCOS临床特征值的相关性分析

统计结果显示，PCOS组hsa_circ_0043533(r=0.399 9，P=0.047 6)和hsa_circ_0097636(r=0.507 5，P=0.009 6)的相对表达量与T水平均呈正相关；正常对照组中hsa_circ_0097636的相对表达量与E2水平有正相关性(r=0.608 8，P=0.005 7)(表5)。

图2 3个验证circRNA在PCOS和正常对照组患者中的表达

表5 Spearman秩相关分析患者临床特征值与差异表达circRNA之间的相关性

注：*P<0.05

五、circRNA对于PCOS的诊断效力

hsa_circ_0043533和hsa_circ_0097636作为诊断指标时，ROC曲线的AUC分别为0.709(95%CI：0.566-0.851)、0.738(95%CI：0.599-0.877)。hsa_circ_0097636联合T作为诊断指标，可得出Logistic回归方程：Logit(P)=-0.206 3+(-2.539× hsa_circ_0097636)+(13.254×T)，AUC为0.893(95%CI：0.807-0.978)，敏感度0.68，特异性为1(图3)。

图3 不同差异表达的circRNA诊断PCOS的ROC曲线

讨论

PCOS的病因至今尚未完全明确，临床表现也存在高度异质性，以卵泡发育障碍和激素合成异常，尤其是雄激素合成亢进为显著特征。现广泛认为PCOS是多重遗传与环境因素共同作用下导致的复杂病症[12]。迄今为止，已有包括MAPK-ERK、Wnt/β-catenin和PI3K-Akt pathways[12-14]等在内的多条信号通路在PCOS发病机制中被提出，这些信号通路包含miRNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等众多非编码RNA分子的参与，为更好地靶向治疗PCOS提供了思路。

CircRNA最早于20世纪70年代在高等植物中被首次发现，但受限于当时的研究手段，其曾一度被认为是转录过程的副产物或由错误剪接所形成。直到近十年，随着高通量测序和生物信息学技术的迅猛发展，人们才认识到circRNA是广泛稳定存在的，且具有相当重要的调节功能[15]。目前，circRNA在转录和转录后水平发挥的多种作用被提出并加以研究[16]，其最为主要的功能是作为miRNA“海绵”：小脑变性相关蛋白1反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as)是circRNA的一种，研究表明其在脑组织中可吸附63个miR-7；在研究斑马鱼中脑的发育时发现，过表达CDR1as会引起miR-7表达下降而导致中脑发育受损[17]。在大多数研究中，circRNA会下调其靶向miRNA的表达，进而上调miRNA下游靶向mRNA的表达以调控基因功能网络。例如，在糖尿病患者视网膜组织中上调circHIPK3会通过“吸附机制”阻断miR-30a-3p的功能而上调下游VEGF-C、FZD4和WNT2的表达，并最终导致内皮增生和血管功能障碍[18]。但近来也有研究指出与前者截然相反的发现：利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除小鼠基因组中的CDR1as位点会导致实验动物脑组织中miR-7表达异常、稳定性下降，而miR-7下游靶基因Fos和Nr4a3表达显著升高，出现感知运动功能和神经精神系统障碍[19]。这些研究表明，circRNA在竞争性内源性RNA(Competing endogenous RNAs，ceRNAs)网络中的作用远比想象的要复杂，还需要更加深入的探索。

相对于circRNA，miRNA在PCOS中的研究则要广泛、成熟许多。如今已有大量具有重要功能的miRNA在PCOS患者外周血、卵泡液和颗粒细胞中被发现：miR-93在PCOS患者脂肪细胞中显著高表达，可通过靶向结合葡萄糖转运体4(Glucose transporter isoform 4，GLUT-4)的3′UTR区下调GLUT-4的表达而导致胰岛素抵抗症状的出现[20]；miR-320a在PCOS患者卵丘颗粒细胞中显著低表达，可引起编码激素合成关键酶的基因Cyp17a1和Cyp19a1的调节障碍，而出现颗粒细胞的雌激素合成缺陷[21]。

鉴于众多学者对于circRNA作为“miRNA海绵”这一特殊功能的报道，本研究通过芯片平台检测及后续qRT-PCR的挑选验证，首次揭示了PCOS患者卵丘颗粒细胞中特异性circRNA的表达。证实hsa_circ_0043533和hsa_circ_0097636在PCOS患者卵丘颗粒细胞中分别显著上调和下调。相关性分析提示，二者的表达与患者睾酮水平呈现正相关性。众所周知，高雄激素血症是PCOS诱发因素和显著特征之一，但有研究指出雄激素受体敲除的小鼠会出现严重的生殖缺陷，这也提示了雄激素在平衡卵泡发育与卵泡闭锁之间的重要作用[22]。本研究中，我们通过miRanda (34.236.212.39/microrna/home.do)和Targetscan (www.targetscan.org/vert_71/)对circRNA和miRNA的相互作用进行了预测。在众多预测结合的miRNA中，我们发现miR-125b和miR-30c有hsa_circ_0097636结合位点，miR-132有hsa_circ_0043533结合位点，而这3种miRNA在之前关于PCOS的研究中均有报道[22-24]。miR-125b为抗凋亡miRNA的一种，在卵巢组织中表达丰富[25]，过高的雄激素可促进miR-125b的表达，进而避免卵泡的凋亡和闭锁[22]，这或许能部分解释伴有高雄激血症的PCOS患者易出现过多卵泡发育。已有报道miR-30c在PCOS患者血清中高表达[23]，我们推测上调表达的miR-125b和miR-30c可能是由于hsa_circ_0097636显著低表达，导致“吸附”减少所致。另有一项基因组水平的筛选实验发现miR-132可抑制体外培养的人卵巢细胞三种甾体激素(P、E2和T)的合成[24]，我们猜测hsa_circ_0043533可能通过“吸附” miR-132来影响PCOS患者卵巢局部的激素合成。总的来说，本研究验证的两种在卵丘颗粒细胞中异常表达的circRNA可能通过特定的circRNA-miRNA相互作用而影响到PCOS患者的卵泡发育和激素合成。

本研究通过绘制ROC曲线评价了不同差异表达的circRNA对于PCOS的诊断效能，对比发现，联合hsa_circ_0097636与T可使诊断效能显著提高。由于circRNA可抵抗RNA酶R的降解，具有足够高的稳定性，其有望在未来作为诊断或筛选PCOS的一个良好生物学分子指标。

综上所述，PCOS患者卵丘颗粒细胞中circRNA hsa_circ_0097636和hsa_circ_0043533的表达水平与正常对照组相比存在显著差异。本研究证实了两种差异表达的circRNA与T水平的相关性，初步验证了联合hsa_circ_0097636与T诊断PCOS的可能性。验证出的两种circRNA可能通过circRNA-miRNA的相互作用参与卵泡发育和激素合成的调控过程继而影响到PCOS的发生发展，但此推论尚需更进一步的实验验证。本研究为深入理解PCOS发病机制和探索诊治方法提供了更为广阔的思路。