复方阿胶浆改善溶血性贫血的代谢调控机制

张 妤， 田俊生

（1.山西药科职业学院，山西 太原030031；2.山西大学中医药现代研究中心，山西 太原030006）

贫血是临床常见的一种血液疾病，容易对机体各项功能产生影响，导致患者精神状态萎靡，生活质量下降，按病因可分为三类，即造血不良性、失血性、溶血性贫血，其中溶血性贫血是由于体内红细胞生存时间缩短、破坏增多，超出了骨髓代偿性造血能力，中医属“血劳” “虚劳” 范畴，原因涉及遗传、 代谢、 感染、 物理化学因素、 机械因素等［1-3］。

复方阿胶浆是代表性的补血药物，由阿胶、红参、熟地黄、党参、山楂配伍而成，具有补气养血的功效，适用于气血两虚、头目眩晕、心悸、失眠、纳呆、白细胞减少、贫血等症状［4］。临床研究显示，它可作为肿瘤放化疗的辅助用药［5-7］，起到保护化疗患者血象、延缓化疗相关性贫血发生、改善临床症状的作用，也可用于不同类型和不同程度的贫血［8］，具有显著的补血效果，而且安全性良好，但其作用机制尚不清楚。

代谢组学利用现代分析技术，可实时、客观地表征机体在生理、病理条件下由各种刺激导致生物体相对分子质量较低的代谢物整体变化，是机体产生的代谢应答反应，代谢产物由机体内源性物质反应产生，代谢组学在研究代谢物变化的同时能反映机体内在条件变化［9-11］。该方法从代谢终端检测生物体代谢轮廓变化，契合中医药及中药复方制剂多成分、多靶点协同作用而共同发挥药效的特点，应用范围广，已见于逍遥散［12-13］、驴胶补血颗粒［14］、沙棘［15］等多种中药药理作用的代谢变化机制研究。另外，核磁共振（NMR） 能快速检测样品信息，在原始图谱中包含样品各代谢物含有量，其信号强度能间接反映待测物浓度，而且样品前处理方法简单，分辨率高，检测成本低［16］。

因此，本研究选用乙酰苯肼（APH） 诱导溶血性贫血大鼠模型，通过1H-NMR 代谢组学方法分析给予复方阿胶浆前后大鼠血清中代谢产物变化及其规律，结合MetPA 通路分析，从系统生物学角度探讨复方阿胶浆改善溶血性贫血的作用机制。

1 材料

复方阿胶浆（山东东阿阿胶股份有限公司，批号1307057）。乙酰苯肼（上海生工生物工程股份有限公司，25 g／瓶，批号RS1014S4011Z）；重水（美国Sigma-Aldrich 公司）。Bruker AVANCEⅢ600 MHz 核磁共振波谱仪 （德国布鲁克公司）；Hemavet950 动物血液分析仪（美国Drew 公司）。SPF 级雄性SD 大鼠，体质量180 ～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2014-0001，实验开始前进行1 周环境适应性训练，饲养室温度（24±1）℃，相对湿度（60±5）%，照明12 h 亮／暗周期，上午8：00开灯，晚上8：00 关灯。

2 方法

2.1 分组及给药 大鼠根据体质量随机分为空白对照组、模型组、给药组，每组12 只。第1 周模型组、给药组分别在第1、4、7 天皮下注射2%乙酰苯肼造模，第1 次剂量100 mg／kg，后2 次减半，造模结束后给药组灌胃给予复方阿胶浆（6 mL／kg），空白对照组、模型组给予等量生理盐水，1 次／d，持续2 周。

2.2 样品收集 末次给药1 h 后大鼠眼眶取血，于肝素抗凝管中迅速旋摇，2 h 后乌拉坦麻醉，股动脉取血，室温下静置30 min 后3 000 r／min 离心15 min，取上层血清，-80 ℃下冷冻保存。

2.31H-NMR 图谱建立及处理 450 μL 血清中加入350 μL D2O，充分振荡，13 000 r／min、4 ℃下离心20 min，移取550 μL 上清于5 mm 核磁共振管中 待 测。 室 温 （25 ℃） 下 于Bruker 600 MHz AVANCE ⅢNMR 波谱仪上测定样品，以Methnol-d4锁场，测定序列CPMG1D，扫描次数64 次，弛豫时间2.0 s，采样时间2.726 s，谱宽12 019.2 Hz。

核磁图谱采用MestReNova 软件进行处理，以肌酸酐甲基峰的化学位移（δ 3.04） 为标准定标，手动进行相位调节、基线校准。对图谱进行初步处理后，剪切区段δ 1.21 ～1.25（乌拉坦）、4.45 ～5.15（残余水峰） 不计入统计，以δ 0.02 为积分单位对化学位移区间δ 0.75～8.55 进行积分，积分数据选用总峰面积归一化处理后导出。所得核磁数据矩阵采用SIMCA-P14.1 软件进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA） 和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），根据分析结果，筛选组间差异性代谢成分，并应用MetaboAnalyst 3.0 平台分析大鼠血清差异代谢产物相关性及其主要代谢通路。

3 结果

3.1 体质量 表1 显示，给药前模型组、给药组大鼠体质量与空白对照组比较显著降低 （P ＜0.05），给药后给药组大鼠体质量略高于模型组高，但无显著性差异（P＞0.05）。

表1 各组体质量比较，n＝12）Tab.1 Comparison of body weights among various groups，n＝12）

表1 各组体质量比较，n＝12）Tab.1 Comparison of body weights among various groups，n＝12）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05

组别 给药前／g 给药后／g 增重／g空白对照组 265.08±14.53 362.78±23.75 97.70模型组 212.37±10.80* 306.81±25.25 94.44给药组 207.95±11.54* 310.01±17.83 102.06

3.2 血常规指标 表2 显示，与空白对照组比较，模型组RBC、HGB、PLT 显著降低，MCV、MPV显著升高（P ＜0.05，P ＜0.01）；与模型组比较，给药组RBC、HGB、PLT 显著升高，MCV 显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各组血常规指标比较，n＝12）Tab.2 Comparison of routine blood indices among various groups，n＝12）

表2 各组血常规指标比较，n＝12）Tab.2 Comparison of routine blood indices among various groups，n＝12）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 RBC（×1012／L） MCV／fL HGB／% PLT（×109／L） MPV／L空白对照组 9.15±0.38 90.02±3.92 180.75±4.74 1 007.91±150.60 5.92±0.36模型组 7.40±0.32* 120.46±6.36* 156.74±10.64** 648.27±219.58** 6.49±0.64*给药组 9.49±0.52△△ 113.83±5.45△ 175.75±3.88△△ 751.42±169.28△△ 6.46±0.55

3.31H-NMR 图谱 根据图谱中化合物的化学位移、裂峰形态、 耦合常数， 参照Chenomx NMR Suite 软件，结合Biological Magnetic Resonance Data Bank（BMRB） 数据库及文献［17-19］ 报道，得到各组大鼠血清1H-NMR 图谱（图1），具体归属见表3。

图1 各组大鼠血清1H-NMR 图谱Fig.1 1H-NMR spectra of rat serum in various groups

3.4 多元统计分析 PLS-DA 集合主成分分析、相关分析、多元线性回归的特点，同时考虑自变量和应变量，能反映数据变异信息［20］。因此，本研究采用PLS-DA 判别分析比较各组大鼠血清代谢物的差异性，结果见图2a，再采用Q2统计量衡量PLS-DA 模型预测能力，假设检验次数设为200，结果见图2b。由此可知，Q2值为0.652，表明预测效果较好；R2X、R2Y 分别为0.753、0.862，表明模型拟合效果理想。

图2a 显示，3 组样品能明显区分，各组之间存在显著差异，空白对照组、模型组分离，表明模型复制成功；给药组、模型组可明显区分，表明给予复方阿胶浆后能改变造模后大鼠内源性代谢产物而发挥作用。为了进一步分析组间差异代谢产物及其变化规律，再采用OPLS-DA 判别分析，过滤X中与Y 不相关信息以增强模型有效性，达到更高的预测效果［21-22］，结果见图3，结合变量权重的重要性排序（VIP）分布，筛选VIP ＞1，同时满足积分数据独立样本t 检验P＜0.05 的差异代谢物［23］。与空白对照组比较，模型组大鼠乳酸、脂质、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸含有量有明显升高，谷氨酰胺、甘磷酸胆碱、β-葡萄糖、甘氨酸、精氨酸、α-葡萄糖含有量显著降低；给药组与模型组对比发现，乳酸、脂质、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸含有量降低，谷氨酰胺含有量升高，见图3，大鼠血清差异代谢产物的相对峰面积见表4。

表3 空白对照组大鼠血清1H-NMR 数据Tab.3 1H-NMR data on rat serum in the blank control group

图2 各组大鼠血清PLS-DA 3D 得分图（a）、模型验证图（b）Fig.2 PLS-DA 3D score plot（a）and model validation plot（b）for rat serum in various groups

表4 各组差异代谢物相对峰面积比较Tab.4 Comparison of relative peak areas of differential metabolites among various groups

表4 各组差异代谢物相对峰面积比较Tab.4 Comparison of relative peak areas of differential metabolites among various groups

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

代谢物 空白对照组 模型组 给药组乳酸 0.025±0.005 0.039±0.008** 0.020±0.007△△脂质 0.002±0.001 0.003±0.001* 0.001±0.001△△N-乙酰糖蛋白 0.012±0.001 0.014±0.001** 0.010±0.001△△谷氨酸 0.008±0.001 0.010±0.001* 0.008±0.001△△谷氨酰胺 0.015±0.002 0.013±0.001* 0.020±0.003△△甘磷酸胆碱 0.010±0.001 0.009±0.001* 0.009±0.002 β-葡萄糖 0.021±0.003 0.017±0.003* 0.014±0.003甘氨酸 0.014±0.001 0.011±0.001** 0.009±0.001△△精氨酸 0.018±0.003 0.014±0.002* 0.011±0.002△α-葡萄糖 0.010±0.002 0.008±0.001* 0.005±0.001△△

3.5 血清差异代谢物的相关性分析及代谢通路分析 大鼠血清差异代谢物的相对峰面积数据导入MetaboAnalyst 3.0 平台中，进行Pearson 相关分析，结果见图4。由图可知，代谢物成分大致分为2类，同一种类代谢物呈正相关，不同种类代谢物之间呈负相关，其中乳酸、脂质、N-乙酰糖蛋白相互之间呈现较强正相关，与甘氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、精氨酸则呈显著负相关，表明APH 诱导的溶血性贫血可能通过多条途径进行机制调节，并且之间可能存在联系，相互影响。

图4 差异代谢产物Pearson 相关分析Fig.4 Pearson correlation analysis of differential metabolites

将差异性代谢物名称输入MetPA，选择rat 模式进行通路分析，结果见图5，同时将代谢通路影响数值设置为0.10［24］，当高于该数值时，即被视为潜在的靶标代谢路径。由图可知，主要代谢通路涉及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢，以及甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢2 条途径，通路影响值分别为0.15、0.29；脂质、N-乙酰糖蛋白未匹配到数据库中成分，而两者在大鼠给药前后存在显著性异，故此结合MetPA 通路分析可知，差异代谢物主要涉及脂质、蛋白质、氨基酸代谢。

图5 差异代谢产物MetPA 通路分析Fig.5 MetPA pathway analysis of differential metabolites

4 讨论

APH 氧化诱导溶血性贫血模型［25］，通过干扰红细胞内多种酶活性，损伤红细胞膜抗氧化系统，破坏其结构稳定性，出现红细胞总数、血红蛋白、血小板数量减少等贫血现象，血象改变的同时造成整个机体内源性代谢改变，对末端代谢产物产生影响。

复方阿胶浆以阿胶、熟地黄补血滋阴，有助于缓解贫血红细胞减少症状，改善机体造血功能；红参增补元气，统摄血液，使气血畅行；党参补充血液，濡养脏腑，滋补津液；山楂康健脾胃，活血化瘀。在中医基础理论指导下，作用于机体发挥消导补气，活血补血的功效，改善贫血症状。

采用核磁共振代谢组学技术，以血清为媒介监测大鼠给药前后内源性代谢产物变化状况，与中药复方多成分共同起效发挥作用相契合，在机体整体水平分析复方阿胶浆改善造血机能的内在机制。研究结果显示，复方阿胶浆能够通过调节溶血性贫血大鼠体内多种内源性代谢产物改善贫血症状。

正常新陈代谢过程中乳酸含量稳定，模型组大鼠红细胞大量破坏，携带、输送氧气能力减弱，引起组织缺氧，表现为机体有氧呼吸能量得不到满足，乳酸生成途径增强；复方阿胶浆给药后，大鼠红细胞水平升高，供氧充足组织消耗血液乳酸生成丙酮酸，进入TCA 循环氧化供能。脂类是机体重要的储能和供能物质，模型组大鼠红细胞碎片中膜脂质成分入血，脂质含量升高，同时可能因为运输氧气不足，导致代谢产能减缓；给药后机体代谢条件得到恢复，脂质代谢增强，相对含量显著降低。蛋白质分解代谢的中间产物是N-乙酰糖蛋白，能够直接反映蛋白质的分解程度，细胞溶血后，机体自身调节分解入血蛋白成分，通过给药调控N-乙酰糖蛋白含量改善蛋白质分解代谢途径。强氧化剂氧化损伤机体抗氧化系统，谷氨酸转化增强，谷氨酰胺含量降低，机体免疫能力下降，肠道细胞能量来源减少，大鼠消化吸收及抵抗能力下降，给药后大鼠体质量增加，谷氨酸、谷氨酰胺含量回调，机体状态得到改善。

综上所述，复方阿胶浆治疗溶血性贫血的内在机制主要涉及脂质代谢、蛋白质及氨基酸代谢，通过调节乳酸、脂质、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺含量，同时调控能量代谢，达到改善溶血性贫血症状的作用。后续可以参考此类方法，探讨复方阿胶浆作用于其他类型贫血发挥疗效的内在机制。