HPLC 法同时测定藿砂颗粒中7 种成分

2019-10-16潘艳琳程心玲翁淑琴

中成药 2019年9期

潘艳琳，程心玲，肖淋，翁淑琴，卓实，肖钦

（福建中医药大学附属人民医院药学部，福建福州350004）

藿砂颗粒由福建中医药大学附属人民医院院内制剂藿砂口服液改进剂型而来，是广藿香、厚朴、泽泻、茯苓等9 味中药材组成的中药复方制剂，具有健脾化湿、和胃止泻的功效，临床上主要用于脾胃不和、脘腹胀痛、呕吐泻泄等病症的治疗。方中广藿香味辛性微温，化脾胃湿滞、避秽和中，砂仁味辛性温，温脾止泻，化湿开胃，两者合为君药；厚朴、陈皮理气燥湿，苍术燥湿健脾，合为臣药；茯苓、泽泻淡渗利湿，神曲和胃消食，合为佐药；甘草调和诸药，为使药，对痞满证、寒湿型肠易激综合征等治疗效果明显［1-5］，但仅检索到臣药苍术中茅术醇、β-桉叶醇含有量测定的报道［6-7］，未涉及君药和其他成分。

中药复方制剂发挥疗效往往是多成分协同作用的结果，仅测定单一药味难以有效地控制其质量均一性和疗效一致性。为了全面控制和提高藿砂颗粒内在质量，参考中药质量标志物确定原则，以君药为主，兼顾臣、佐、使药，本实验采用HPLC 法同时测定君药藿香主要成分广藿香酮，臣药厚朴主要成分和厚朴酚、厚朴酚，佐药泽泻主要成分24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B，茯苓主要成分去氢土莫酸、茯苓酸的含有量，为该制剂质量标准的提高完善提供理论依据和实验基础。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；XS-205DU 型电子天平（万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。和厚朴酚（110730-201614，含有量 99.3%）、厚朴酚（110729-201714，含有量100.0%）、23-乙酰泽泻醇B（111846-201705，含有量99.7%）对照品购于中国食品药品检定研究院；广藿香酮（23800-56-8，含有量98%）、茯苓酸对照品（29070-92-6，含有量98.0%）对照品购于上海纯优生物科技有限公司；24-乙酰泽泻醇A（18674-16-3，含有量98.0%）、去氢土莫酸（6754-16-1，含有量98.0%）对照品购于南京森贝伽生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。藿砂颗粒（每袋装10 g，批号20180919、 20180928、20181009）购于福建中医药大学附属人民医院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～13.0 min，52.0%A；13.0 ～18.0 min，52.0%→65.0%A；18.0 ～39.0 min， 65.0%→76.0%A； 39.0 ～47.0 min，76.0%→90.0%A； 47.0 ～55.0 min， 90.0%→52.0%A）；体积流量0.9 mL／min；柱温30 ℃；0～18.0 min 在310 nm 波长下检测广藿香酮［8-9］，18.0～30.0 min 在294 nm 波长下检测和厚朴酚、厚朴酚［10-12］，30.0 ～55.0 min 在210 nm 波长下检测24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸［10，13-14］；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取广藿香酮、和厚朴酚、厚朴酚、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸对照品适量，甲醇分别制成0.292、 0.948、 1.210、 0.172、 0.574、 0.238、0.306 mg／mL，精密吸取适量，甲醇制成含广藿香酮14.6 μg／mL、和厚朴酚47.4 μg／mL、厚朴酚60.5 μg／mL、24-乙酰泽泻醇A8.6 μg／mL、23-乙酰泽泻醇B 28.7 μg／mL、去氢土莫酸11.9 μg／mL、茯苓酸15.3 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液取颗粒适量，研细，过80 目筛，精密称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按照处方和生产工艺，分别制备缺广藿香、厚朴、泽泻、茯苓的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由图可知，各成分均能达到有效分离，分离度均大于1.5；理论塔板数按各成分色谱峰计，均大于3 000；阴性样品溶液相应位置无其他色谱峰，表明阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于6 个20 mL 量瓶中，甲醇稀释成25 倍梯度质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得广藿香酮、和厚朴酚、厚朴酚、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸峰面积RSD 分别为1.03%、0.85%、0.68%、1.15%、0.94%、1.20%、1.02%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验取同一批颗粒（批号20180919），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得广藿香酮、和厚朴酚、厚朴酚、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸含有量 RSD 分别为 1.66%、 0.57%、 1.53%、0.88%、0.44%、1.91%、0.75%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验取同一批供试品溶液（批号20180919），室温下放置0、2、4、8、16、24 h 后在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得广藿香酮、和厚朴酚、厚朴酚、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸峰面积RSD 分别为0.99%、 0.83%、 0.71%、 1.47%、 0.82%、1.18%、1.05%，表明溶液在24 h 稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验取含有量已知的颗粒（批号20180919）适量，研细，过80 目筛，精密称取6 份，每份0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（0.331 mg／mL 广藿香酮1.0 mL、0.679 mg／mL 和厚朴酚2.0 mL、0.539 mg／mL 厚朴酚3.0 mL、 0.194 mg／mL 24-乙酰泽泻醇A 1.0 mL、0.681 mg／mL 23-乙酰泽泻醇B 1.0 mL、0.253 mg／mL 去氢土莫酸1.0 mL、0.402 mg／mL茯苓酸1.0 mL），按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，广藿香酮、和厚朴酚、厚朴酚、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸平均加样回收率分别为97.61%、99.59%、100.03%、96.98%、98.57%、97.26%、98.29%，RSD 分别为 1.24%、 0.73%、 0.90%、 1.61%、1.36%、0.92%、1.03%。

2.4 样品含有量测定取3 批颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行3 份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 讨论

本实验比较了不同提取溶剂（50%甲醇、甲醇［10-11，14］、50%乙醇、乙醇［8-9，12］）、提取方法（超声［10-11，13-15］、回流［9］）、提取时间（15、 30、45 min）对藿砂颗粒中广藿香酮、和厚朴酚、厚朴酚、24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、去氢土莫酸、茯苓酸7 种成分含有量的影响，最终确定供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min，此时各成分提取完全，同时干扰少，重复性良好。