发酵肉用耐高温产香葡萄球菌优质菌株的筛选

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吉首大学化学化工学院 湖南吉首 416000

纯种发酵技术已成为现代发酵肉制品加工中的重要技术手段，它能显著提高发酵肉产品的质量和安全性[1]。研究发现，葡萄球菌在发酵肉制品加工中起着产香、促进发色和提高发酵肉制品安全性等重要作用，被认为是发酵肉中的功能性微生物成分[2]。肉葡萄糖球菌与木糖葡萄球菌是发酵肉制品中，受到关注和应用最广泛的两种菌[3～5]，它们在发酵肉制品的低温腌制过程中生长缓慢，而在烘烤过程中又会由于高温而失活。迄今仍未见有适用于发酵肉用的耐高温产香葡萄球菌的分离、纯化和鉴定的研究报道。使用包含耐高温产香葡萄球菌在内的纯种发酵技术，有望缩短发酵肉的生产时间，提高产品质量。因此，本文从湘西土家腊肉中进行耐高温葡萄球菌的筛选、分离纯化和鉴定，希望获得能用于发酵肉的耐高温葡萄球菌优良菌种，为发酵肉加工新工艺的开发和发酵肉制品质量与安全的提高，提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

湘西腊肉，湘西农户家收购；

伊利脱脂奶粉和全脂奶粉，内蒙古伊利实业集团股份有限公司；

干酪素，西陇化工厂；

精氨酸等氨基酸，Biosharp公司；

牛肉浸膏、蛋白胨、D-甘露醇等，国药集团；

耐热脱氧核糖核酸酶培养基、细菌生化反应鉴定管，杭州滨和微生物公司。

SPX-250B-Z恒温生化培养箱、YXQ-SG46-280S手提式压力蒸汽灭器，上海博讯实业公司；

VS-1300L-U超净台，苏州安泰空气技术公司；

BA210生物显微镜，麦克奥迪实业集团公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制

各种微生物培养和检测培养基等按照参考文献[6]进行配制。

1.2.2 菌株的分离纯化

取10.0g绞碎腊肉加于90.0mL无菌蛋白胨水中，200r/min水浴摇床震荡60min，然后静置1h，取样在MSA液体培养基中37℃培养24h后，再取样在MSA固体培养基上37℃培养24h。挑取符合葡萄球菌特征的单菌落用平板划线法纯化。纯化后镜检，并对纯菌种做革兰氏染色以及细胞形态等检验。

1.2.3 耐高温葡萄球菌优质菌株的筛选路线

在MSA琼脂培养基上生长的菌株→50℃培养筛选→革兰氏染色阳性、球状、过氧化氢酶阳性实验→不产粘液→呋喃唑酮敏感性试验→进行发酵剂基本要求实验(不产色素，耐酸，不分解精氨酸，不产生物胺)→符合产香基本要求实验(可分解蛋白质、脂肪)→硝酸盐还原酶检测(挑选红圈直径大于1.2cm的菌株)→产香感官检验→菌株安全性检测(凝固酶、耐热核酸酶的检测，溶血试验)→菌株鉴定。

1.2.4 菌株的筛选方法

(1)过氧化氢酶阳性实验。

取50℃培养24h后的菌体溶于有5%过氧化氢的载玻片上，产气泡为阳性结果，反之为阴性结果。

(2)产粘性实验。

菌株50℃培养24h后用接种针挑取菌落观察粘性情况。

(3)呋喃唑酮敏感性实验。

把培养18h的菌体涂在MSA平板，将100μg/片的呋喃唑酮贴在平板上，50℃培养24h观察，出现抑菌圈者为葡萄球菌。

(4)产色素的检测。

MSA培养基上添加30%的灭菌全脂奶粉，然后接种菌株并于50℃培养24h，再于室温下培养3d，观察色素产生情况。

(5)耐酸性检测。

将菌种接种于pH值5.5的MSA液体培养基，50℃培养24h后看肉汤是否浑浊。

(6)分解精氨酸的检测。

在精氨酸发酵管和对照管中接种，用无菌液体石蜡封住培养基液面，阳性结果判定依据为：实验管为紫红色，对照管为黄色。若两管均为黄色，结果为阴性。

(7)生物胺的检测。

在氨基酸发酵管和对照管中，用无菌液体石蜡封住培养基液面，37℃培养18～24h，阳性结果判定依据为：实验管为紫红色，对照管为黄色，为阳性；若两管均为黄色，结果为阴性。

(8)蛋白酶活性检测。

分别在脱脂奶粉(SM)培养基和酪蛋白(CA)培养基上接种，30℃培养5d后观察两种培养基上菌落周围是否产生透明圈，CA培养基上需滴加10%的三氯乙酸。

(9)脂肪酶活性检测。

在脂肪酶检测平板上30℃培养5d后观察菌落周围是否产生透明圈。

(10)硝酸盐还原酶活性

在硝酸盐还原酶检测平板上50℃培养8h，向平板倾倒培养基等量的GriesS试剂，倾倒溶液后观察菌落周围是否呈现红圈。

(11)产香感官检测。

将菌株活化两次，再分别等量接种于肉浸汁肉汤培养基，37℃培养10d，以不接菌的空白肉汤培养基为对照，由5人感官评价其香气产生状况，挑选出有浓郁水果香味的菌株，进行菌株的安全性检测。

1.2.5 安全性检测

(1)凝固酶的检测。

取2.5mL的兔血浆稀释液与0.5mL新鲜葡萄球菌培养液混合，在50℃培养1h和4h后观察结果，出现胶状或固状的凝块为阳性，纤维状为弱阳性。用金黄色葡萄球菌作对照。

(2)耐热核酸酶的检测。

将新鲜培养的菌株倾注到DNA培养基上，培养24～48h后，出现红色为阳性。

(3)溶血试验。

取一小环菌体在血平板上划线，于37℃培养24、48、72h后观察结果，出现溶血圈者为阳性结果。用金黄色葡萄球菌作对照。

1.2.6 菌种鉴定

(1)形态学鉴定。

观察培养基上菌落的形状、颜色、大小等形态特征并将纯菌株G染色，于光学显微镜下观察菌体细胞的形态。

(2)菌株的生理生化鉴定。

将筛选得到的菌株接种于微量生化鉴定管中，37℃培养18～72h，将实验结果填写在生化鉴定单上，并得出相应的编码值，检索细菌生化鉴定编码表，鉴定到种。

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离纯化

采用MSA培养基，将腊肉样品的肉汤悬浊液进行涂布、划线培养后，得到38株分离的单菌落，标记为S1～S38。图1、图2分别为涂布培养和划线培养结果。

2.2 葡萄球菌的初筛

对S1～S38革兰氏染色及镜检、过氧化氢酶实验，结果为G+、球形、过氧化氢酶阳性，可能为微球菌或葡萄球菌。

2.3 葡萄球菌的复筛

对初筛得到的38株菌株进行产粘液、呋喃唑酮、产色素、耐酸、分解精氨酸、产生物胺、分解蛋白质和脂肪、硝酸盐还原酶、产香感官等实验，以得到不产粘液、不产色素、耐酸、不产生物胺、可分解蛋白质和脂肪、产硝酸盐还原酶、产香的葡萄球菌，实验结果如表1所示。

图1 葡萄球菌涂布培养

图2 葡萄球菌划线培养

葡萄球菌如果产粘液状的代谢产物，会不利于发酵肉制品的感官和组织状态。表1显示，38株菌株在产粘液实验中，仅有S2、S4、S5、S6、S9、S10、S11、S12、S15、S16、S17、S19、S20、S21、S22、S23、S25、S26、S28、S29、S30、S32、S33、S35、S36共25株不产粘液，因此对它们进行下一步的实验。

在呋喃唑酮敏感性实验中，以上25株菌株均出现大于15mm的抑菌圈，说明这25株菌株为葡萄球菌，而非微球菌。图3为其中S10菌株的呋喃唑酮敏感性实验结果。

同样，葡萄球菌不能产有颜色的代谢产物，否则会影响发酵肉制品的色泽。在产色素试验中，有S4、S5、S9、S10、S19、S20、S21、S25、S28、S29共10株不产色素，因此对它们开展下一步的实验。图4为其中S20菌株的产色素实验结果。

表1 葡萄球菌筛选项目及结果

注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。

发酵肉制品生产用葡萄球菌发酵剂需能耐受乳酸菌所产生的酸性环境[7]。在耐酸性实验中，以上10株菌株均呈现耐酸性，如图5所示，培养液中有浑浊物生成，代表有菌株生长。

图3 呋喃唑酮敏感性实验结果

图4 菌株S20产色素实验结果

图5 耐酸性实验结果

图6 分解精氨酸实验结果

在分解精氨酸实验中发现，S4、S5、S9、S10、S20、S28、S29这7株菌株不分解精氨酸，说明这些菌株不会产生脱氨酶，不会因产生氨气而影响发酵肉制品的风味。图6为其中S20菌株的精氨酸检测结果，试验管和对照管均变为黄色。

图7 产生物胺检测结果

图8 蛋白质分解检测结果

生物胺是一些有机碱性含氮小分子化合物，它们在植物、动物、微生物细胞中都存在，具有一定的生理活性。而在发酵食品中，一些微生物对某些游离氨基酸作用会产生大量生物碱。过多摄入生物碱则会给人体健康带来严重问题[8]。因此，肉制品发酵剂不能不产生物胺。在生物胺实验中发现，S4、S5、S9、S10、S20这5株菌株不产生物胺。图7为其中S5菌株的生物胺检测结果，所有试管均变为黄色。

发酵肉制品中滋味成分和挥发性风味成分的形成主要依靠蛋白质和脂肪的分解和氧化，因此发酵剂需要具有一定的分解蛋白质和脂肪的能力[9]。在蛋白质和脂肪分解实验中发现，S5、S9、S10、S20这4株菌株均可分解蛋白质和脂肪。图8为其中S9菌株的分解蛋白质实验结果，图9为其中S4菌株的分解脂肪实验结果。

图9 脂肪分解实验结果

图10 硝酸盐还原酶活性实验结果

在硝酸还原酶活性实验中，以上4种菌株的红圈都大于1.2cm，说明4种菌株都具有硝酸盐还原能力，具有在发酵肉制品加工中发色和产风味的作用[10]。图10为其中S5菌株的硝酸盐还原酶活性实验结果。

微生物菌株的种类与发酵肉制品的挥发性风味的形成有密切的关系[11]。在感官分析实验中发现，以上4种菌株均有浓郁的水果香味，其中以S5最为突出。

图11 耐热核酸酶检测结果

溶血素、凝固酶、耐热核酸酶是致病性葡萄球菌的毒力因子[12]。对分离筛选到的4株葡萄球菌的安全性进行分析，发现凝固酶、耐热核酸酶、溶血性实验全部为阴性，这说明分离到的葡萄球菌是安全的。图11为耐热核酸酶实验结果。

综上可知，分离得到的菌株中65.8%菌株不产粘液，26.3%菌株不产色素并耐酸，18.4%菌株不分解精氨酸，13.2%菌株不产生物胺，10.5%菌株具有分解蛋白质、脂肪和硝酸盐还原能力，并产浓郁水果香味，即S5、S9、S10、S20这4株葡萄球菌。对这4株菌株进行安全性分析，表明这4株菌株可安全使用。

2.4 菌株的形态学和生物学特征

2.4.1 形态学特征

对菌株S5、S9、S10、S20进行形态学特征分析，结果发现：在MSA固体培养基上于37℃培养2d后，菌落为白色，圆形，中央凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，菌落直径约lmm；在液体培养基中于37℃培养24h，细菌生长迅速，到达最大浊度后菌体缓慢沉淀至试管底部，菌体呈乳白色。显微镜下，细胞呈球状，并团块状或葡萄串状排列。

2.4.2 菌株的生理生化鉴定

由形态学特征和表2结果，鉴定4种葡萄球菌分别为1株表皮葡萄球菌，2株华纳氏葡萄球菌以及1株木糖葡萄球菌。

表2 葡萄球菌的生理生化鉴定结果

注：表中“+”为阳性，“-”为阴性。

3 结论

从湘西传统发酵腊肉中筛选到4株优良产香耐高温葡萄球，鉴定结果为1株表皮葡萄球菌，2株华纳氏葡萄球菌以及1株木糖葡萄球菌。4菌株的凝固酶、耐热核酸酶、溶血安全性检验结果皆为阴性，说明这些菌株有望安全地用于发酵肉制品加工中。