基于Oncomine数据库分析ENO2在肾透明细胞癌中的表达和临床意义

周立斌，龙慧民

(宁波市医疗中心李惠利医院泌尿外科，浙江宁波 315040)

肾癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常见的肾脏恶性肿瘤，透明细胞肾癌 (clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)占所有RCC的80%。随着手术水平的不断进步及对肾癌的分子生物学和基因组学的深入研究，肾癌患者生存时间显著延长，患者生活质量明显提高[1]。然而，90%肾癌导致的死亡与转移密切相关。虽然有不同的肾癌诊断和预后模型，但由于缺乏特异性和敏感性，其临床使用价值非常有限[2]。因此，深入研究ccRCC发生发展的分子机制将有利于发现诊断和预后的标志物及开发新的分子靶向药物。

癌症相关数据的挖掘已在泌尿肿瘤中广泛应用，为深入研究肾癌的发病机制提供了重要的线索[3-4]。本研究将充分利用Oncomine数据库资源，分析烯醇化酶2(enolase 2，ENO2)在ccRCC中的表达情况及其与ccRCC的临床分期、分级及预后的关系，为进一步研究ENO2在ccRCC中发生发展的分子作用机制提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)中根据作者需求设定筛选和挖掘数据的条件。本研究中，①“Gene：ENO2”；②“Cancer Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma”；③“Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis”；④临界值设定条件(Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%)作为筛选差异表达的条件。共筛选出肾透明细胞癌与正常肾组织的基因表达谱数据(6项研究7个子数据集)，ENO2在肾透明细胞癌组织和正常组织中存在显著差异。然后我们在之前筛选的基础上，选择“Clinical Outcome：Survival Status”进行进一步筛选，最后根据Group By的下拉菜单选择我们需要分析的肾透明细胞癌临床因素，包括T分期、N分期、M分期、TNM总分期、5年生存时间。

1.2 实验方法由于Oncomine数据库非免费，我们先选择需要的数据库的柱状图，然后右击鼠标，选择“审查元素”，将map处的数据拷贝保存到data.txt文件中。然后利用R语言中的devtools和Oncomine包提取data.txt文件中的相关临床数据，具体代码如下：①library(devtools)；②install_github("yikeshu0611/Oncomine")；③library(Oncomine)；④a=Oncomine_bar("data.txt")；⑤head(a)；⑥write.table(a,"a.txt",sep=" ",quote=FALSE)，最后对新得到的a.txt文件中的数据进一步分析。

1.3 统计学方法所有数据采用SPSS 23进行统计学分析，两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用One-way ANOVA方法，预后分析采用Kaplan-Meier模型，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ENO2在不同肿瘤中的表达情况Oncomine 数据库中共收集了447项有关ENO2在肿瘤与正常对照之间比较的研究，有 42项有统计学差异，其中29项ENO2高表达，13项ENO2低表达。有7项肾癌相关的研究均表明ENO2表达升高(表 1)。

2.2 ENO2在肾透明细胞癌中的表达情况利用Oncomine数据库进一步分析ENO2在肾透明细胞癌中的表达情况，发现自2003年起共有6项研究，7个肾透明细胞癌数据集涉及ENO2在肾透明细胞癌和正常组织中的表达，共包括1 126例标本。相关研究分别发表于Cancer Res[5]、Clin Cancer Res[6-7]、BMC Cancer[8-9]、TCGA。接着我们利用R语言分别提取Oncomine 数据库中7个ENO2相关的肾透明细胞癌数据集的数据，并对ENO2在肿瘤与对照组的差异表达进行分析，结果显示在 BEROUKHIM等[5]、GUMZ等[6]、JONES等[7]、LENBURG等[8]、YUSENKO等[9]、TCGA等6项研究7个数据集研究中，ENO2在肾透明细胞癌中均显著高表达 (图1，P<0.001)。

表1 Onconime 数据库中ENO2在不同肿瘤中的表达

肿瘤类型研究数(癌症vs.正常)ENO2高表达ENO2低表达脑及中枢神经系统肿瘤09宫颈癌30食管癌20肾癌70白血病22肺癌40淋巴瘤01黑色素瘤10肉瘤40胰腺癌20前列腺癌01其他肿瘤40显著性差异的研究2913

图1 Oncomine 数据库中ENO2在不同肾透明细胞癌数据集中的表达

A：Beroukhim研究，癌症组1为遗传性ccRCC，癌症组2为非遗传性ccRCC；B：Gumz研究；C：Lenburg研究；D：Yusenko研究；E：Jones研究；F：TCGA数据库。*P<0.001。

2.3 ENO2与肾透明细胞癌临床分期分级及预后的关系为明确ENO2与肾透明细胞癌的临床相关性，我们利用R语言提取Oncomine数据库中ENO2基因表达与分期、分级及预后的数据，经分析发现ENO2基因的表达水平与肾透明细胞癌的分期和分级呈正相关，而与5年总生存时间呈负相关(图 2)。

图2 ENO2表达与ccRCC分期、分级及预后之间的关系

A：ENO2与ccRCC T分期之间的关系；B：ENO2与ccRCC N分期之间的关系；C：ENO2与ccRCC M分期之间的关系；D：ENO2与ccRCC TNM总分期之间的关系；E：ENO2与ccRCC 分级之间的关系；F：ENO2与ccRCC 5年总生存时间之间的关系。

3 讨 论

ENO2，又称神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，是一种含433个氨基酸的长链酸性二聚体蛋白，包括两种烯醇化同工酶，γγ和αγ，主要分布在神经细胞、神经内分泌细胞及由此来源的肿瘤细胞[10]，但在红细胞、血小板、乳腺组织、前列腺和子宫中也有少量表达[11]。它在糖酵解中起重要的作用，可促进β-甘油磷酸酯转化为二羟磷酸丙酮。而糖酵解可通过提供肿瘤所需的能量从而显著促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤的进展中起重要的作用[12-13]。

ENO2在多种肿瘤中过度表达，如胃癌[14]、前列腺癌[15]、胶质瘤[16]、肺癌[17]等。胶质瘤细胞在低氧和血清饥饿的情况下，ENO2表达显著升高，而抑制其表达后可抑制肿瘤细胞的生长，证实在应激状态下肿瘤细胞通过糖酵解维持肿瘤细胞的生长[16]。由此可见，通过抑制ENO2参与的糖酵解，可作为肿瘤治疗的潜在靶点。同时研究发现，ENO2与肿瘤的转移相关，ENO2的C末端的肽可通过RhoA激酶来调控肌动蛋白细胞骨架结构，参与胶质瘤细胞的转移[16]。近几年ENO2的研究主要集中在分子标志物的研究[18]，临床上已用于肺癌等肿瘤的协助诊断。有研究发现，组织及血清中的ENO2水平在多种肿瘤中起着重要的作用，如在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中ENO2可作为诊断、预后、随访及治疗有效性的标志物[19-21]；在精原细胞瘤中可作为诊断的标志物；在类癌中可作为诊断、复发及治疗有效性的标志物；在甲状腺髓样癌中可作为复发及治疗有效性的标志物；在神经母细胞瘤中可作为诊断、预后、复发和治疗有效性的标志物[12]。最近研究发现，血清中ENO2的水平与急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的免疫类型、风险分层和血清中乳酸脱氢酶含量密切相关。多因素分析发现ENO2高表达可作为成人ALL的独立预后因素。进一步研究发现ALL患者接受化疗后ENO2 mRNA表达水平降低，然而复发时表达显著升高。ENO2 mRNA表达升高，可通过上调糖酵解相关基因的表达和促进Akt活性诱导细胞增殖、糖酵解和糖皮质激素耐受。因此，ENO2可作为ALL患者化疗有效性及复发的标志物，为ALL的治疗提供潜在的治疗方案[22]。

那么ENO2是否与肾透明细胞癌相关，是否可作为肾透明细胞癌的诊断、预后、复发及治疗有效性的标志物，目前尚不明确。为此，我们首先利用Oncomine数据库挖掘ENO2基因在不同肿瘤组织中的表达情况，结果发现，在有统计学差异的42项研究中，有29项研究显示ENO2在肿瘤中高表达，其中包括肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病等。随后进一步分析了7个肾透明细胞癌数据集中1126例标本，发现ENO2在ccRCC中高表达，而且与ccRCC的分期分级及预后密切关系。研究结果显示，ENO2的表达量越高，ccRCC分期分级越高，两者密切相关，P<0.05；同时我们还发现ENO2表达高的患者，其总生存时间显著降低。

综上所述，我们通过Oncomine数据库中的大样本数据，发现ENO2在ccRCC组织中表达升高，且与ccRCC分期、分级及预后密切相关，为我们进一步深入研究肾透明细胞癌的发生发展机制、诊断预后标志物及靶向治疗药物提供可靠的理论依据，有利于我们深入研究ENO2在肾透明细胞癌中的作用机制。但是由于本研究主要基于Oncomine数据库中的数据，不同的研究之间存在一定的差异性，而且有些研究的样本量过小，分析得到的结果可能与实际结果有一定的差异性。因此，单纯地利用Oncomine数据库存在一定的缺陷和局限性，在未来的研究中我们将进一步在肾癌手术标本中验证其表达及在细胞和动物实验中探索ENO2的作用及调控机制。