循环肿瘤细胞数量及分型检测在肾癌疗效评价中的作用

王振龙，张 鹏，薛玉泉，张亚萍，杨小杰，薛 力，李和程，李洪亮，刘文聘，种 铁

(西安交通大学第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004)

肾癌(renal cell carcinomar，RCC)是泌尿系统常见肿瘤，发病率逐年上升，每年增长约2%～4%，即使手术治疗，术后仍有约20%～40%的患者出现疾病进展，5年生存率仅有11%[1-2]。寻找合适的评价肾癌治疗效果的方法，实时监测肾癌治疗后的转归，对肾癌治疗后的疾病进展做到早发现早治疗意义重大。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周循环血中的肿瘤细胞，被认为是肿瘤转移的“种子”。研究表明，CTCs与多种肿瘤的转移和复发显著相关[3-4]。我们前期研究也发现了CTCs数量及分型检测具有评估肾癌进展风险的作用[5]。CTCs数量及分型检测能否作为评价肾癌疗效的早期、敏感的方法，值得深入研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料入组患者为2015年6月至2016年9月西安交通大学第二附属医院收治的47例肾癌患者，均经病理学确诊且既往未经任何治疗。年龄47～82岁，平均 64.5 岁；男性33例，女性14例；TNM 分期采用国际抗癌联盟2003年制定的标准：T1期 34 例，T2期 10 例，T3期 3 例，无T4期病例；手术方式：根治性肾切除术10例，肾部分切除术37例；术后病理诊断：肾透明细胞癌45例，乳头状细胞癌2例。本研究通过了西安交通大学第二附属医院医学伦理委员会审核，标本的采集和检测均经患者知情同意。

1.2 监测与随访所有患者行术前检查并进行CTCs检测，术中记录肿瘤分级分期等信息，术后每3个月复查一次，检查项目包括，胸部、上腹部及双肾计算机断层扫描(computed tomography，CT)平扫或增强(怀疑有转移及复发患者加做增强CT)检测评估肿瘤有无远处转移；外周血CTCs检测，包括CTCs数量及分型检测，分别得到CTCs总数及上皮型、混合型、间质型CTCs数量，并计算间质型CTCs比例(间质型CTCs数量/CTCs总数)。肾癌转移患者在给予治疗前及治疗后1月增加外周血CTCs分型检测，后续常规复查每3个月1次，均完成至少1年随访。

1.3 研究分组按以下方案进行分组：①影像学发现远处转移的患者，按进行治疗(包括切除转移灶或靶向治疗)和未予治疗分组，比较CTCs数量及间质型CTCs比例在2组患者中的差异，评价CTCs分型检测对转移肾癌疗效评价的作用。②CTCs呈进展趋势的患者(不论影像学是否发现转移灶)，按进行分子靶向治疗和未进行靶向治疗分组，比较CTCs数量及间质型CTCs比例在2组患者中的差异，评价分子靶向治疗对CTCs数量及分型的作用。

1.4 分子靶向治疗方案分子靶向药物治疗用药及辅助治疗用药，均选择索拉非尼0.8 g/d口服。

1.5 外周血CTCs数量及CTCs分型检测方法(纳米膜过滤、RNA原位杂交法)

1.5.1样本采集 使用8号采血针和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝采血管采集7.5 mL外周血。将样本保存管插入孔内，使孔中针头刺穿样本保存管橡胶塞，EDTA抗凝采血管内的血液将自动输入样本保存管内。待样本保存管内的液面不再上升后，拔出样本保存管，上下颠倒混匀10次，室温放置30 min。

1.5.2CTCs的分离富集 离心去除上清，固定剂固定8 min。通过真空歧管将过滤器与真空泵连接，将样本保存管中的液体转移至纳米膜过滤器中，甲醛溶液室温固定60 min。

1.5.3上皮型、混合型、间质型CTCs的分型鉴定 固定后的样本进行探针杂交CTCs分型鉴定。透化剂孵育5 min，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤3次。消化酶孵育60 min，PBS洗涤3次。加入探针工作液，(40±1)℃孵育3 h，洗涤3次。加入预扩增工作液，(40±1)℃孵育30 min，洗涤3次。加入扩增工作液，(40±1)℃孵育30 min，洗涤3次。加入显色工作液，(40±1)℃孵育30 min，洗涤3次，在样本上加抗淬灭剂(含DAPI)。

CTCs分型检测技术采用多重RNA探针，分别针对上皮型CTCs特异性基因EpCAM、CK8、CK18、CK19，间质型CTCs特异性基因Vimentin、Twist进行检测(探针序列见表1)。使用扩增探针与标记有荧光基团的上述分型标记探针进行杂交，产生荧光信号，利用自动识别系统阅读荧光信号，通过不同颜色荧光信号，自动判断CTCs分型检测结果。免疫荧光检测标准判读：上皮型CTCs显示为红色荧光信号点，间质型CTCs显示为绿色荧光信号点，同时表达上皮型和间质型特异性基因的CTCs为混合型(同时显示红色荧光及绿色荧光信号点)。

表1 核酸探针序列

基因序列(5′→3′)EpCAMTGGTGCTCGTTGATGAGTCAAGCCAGCTTTGAGCAAATGAAAAGCCCATCATTGTTCTGGCTCTCATCGCAGTCAGGATCTCCTTGTCTGTTCTTCTGACCTCAGAGCAGGTTATTTCAGCK8CGTACCTTGTCTATGAAGGAACTTGGTCTCCAGCATCTTGCCTAAGGTTGTTGATGTAGCCTGAGGAAGTTGATCTCGTCCAGATGTGTCCGAGATCTGGTGACCTCAGCAATGATGCTGCK18AGAAAGGACAGGACTCAGGCGAGTGGTGAAGCTCATGCTGTCAGGTCCTCGATGATCTTGCAATCTGCAGAACGATGCGGAAGTCATCAGCAGCAAGACGCTGCAGTCGTGTGATATTGGCK19CTGTAGGAAGTCATGGCGAGAAGTCATCTGCAGCCAGACGCTGTTCCGTCTCAAACTTGGTTCTTCTTCAGGTAGGCCAGCTCAGCGTACTGATTTCCTCGTGAACCAGGCTTCAGCATCVimentinGAGCGAGAGTGGCAGAGGACCTTTGTCGTTGGTTAGCTGGCATATTGCTGACGTACGTCAGAGCGCCCCTAAGTTTTTAAAAGATTGCAGGGTGTTTTCGGGCCAATAGTGTCTTGGTAGTwistACAATGACATCTAGGTCTCCCTGGTAGAGGAAGTCGATGTCAACTGTTCAGACTTCTATCCCTCTTGAGAATGCATGCATTTTCAGTGGGCTGATTGGCACTTACCATGGGTCCTCAATAACD45TCGCAATTCTTATGCGACTCTGTCATGGAGACAGTCATGT

1.5.4检测结果的判读标准 本研究将CTCs数量及间质型CTCs比例同时增加认为CTCs进展；CTCs数量及间质型CTCs比例同时减少认为CTCs下降；CTCs数量及间质型比例变化趋势不相符定义为CTCs趋势待定。

1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 20.0进行分析，连续性变量使用均值、标准差以及波动范围的表示方法，类别变量使用频数进行表示，连续性变量根据是否符合正态分布采用t检验或秩和检验，类别变量采用Pearsonχ2检验或Fisher’s确切概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CTCs分型检测对肾癌治疗的实时监测作用

1例肾癌(T1bN0M0)行根治性肾切除患者，术后3月检测CTCs呈现进展趋势，给予分子靶向药物索拉菲尼辅助治疗0.8 g/d，持续用药3个月后停药，复查CTCs数量及间质型CTCs比例均呈现下降趋势。但在术后15个月(即停用辅助治疗后9个月)，检测CTCs数量及间质型CTCs比例再次呈现上升趋势，影像学检查未见异常，术后18个月CT发现肺转移，与影像学检测比较，CTCs能提早3个月发现肿瘤的进展。给予索拉菲尼靶向治疗，术后21月(即靶向治疗3月后)复查CTCs较治疗前呈现下降趋势，术后24月(即靶向治疗6月后)胸部CT显示转移灶由治疗前最大径13 mm缩小至10 mm，缩小23.07%，CTCs呈现的下降趋势比影像学发现转移灶缩小提早3个月(图1)。

1例左肾癌(T2N0M0)患者行左肾根治性切除术，术后3个月发现CTCs数量及间质型细胞比例增加，影像学检查未发现异常；术后6个月CT及PET-CT发现右侧肾上腺转移，予右肾上腺转移灶切除，患者未同意应用分子靶向治疗，术后CTCs呈现下降趋势。术后24个月复查时发现CTCs再次出现进展趋势，同时CT发现左侧肾上腺转移灶，予左侧肾上腺切除，联合分子靶向治疗，治疗后CTCs呈现下降趋势(图2)。以上2例接受CTCs监测的个案病例，提示CTCs分型检测具有实时、早期评价疾病进展及治疗转归的作用。

图1 肾癌术后肺转移患者CTCs变化及CT表现

A：CTCs随访监测结果柱状图；B：术前肾CT轴位图(示左肾中部55×47 mm肾门肿瘤)；C：分子靶向治疗前(示肺转移灶表现，转移灶最大径13 mm)；D：分子靶向治疗半年后(肺转移灶较治疗前最大径缩小至10 mm)。AT：分子靶向辅助治疗；T：分子靶向治疗。

图2 左肾癌术后肾上腺转移患者CTCs变化及CT表现

A：CTCs随访监测结果柱状图；B：术前PET-CT示原发左肾癌；C：左肾根治性切除术后6月PET-CT发现右肾上腺占位，行右肾上腺肿瘤切除，术后病理证实右肾上腺转移癌；D：术后24月CT发现左肾上腺肿瘤，行左肾上腺切除，术后病理证实左肾上腺转移癌；E：左肾上腺转移瘤切除术后复查CT，未见局部异常。RAC：发现右肾上腺转移，行转移灶切除；LAC：发现左肾上腺转移，行转移灶切除。

2.2 CTCs分型检测对转移肾癌疗效评价的作用47例患者均完成12～27个月的随访，平均随访时间(13.0±8.5)个月。其中5例在随访期发生远处转移(1例肾上腺转移，4例肺转移)。转移患者中，3例给予治疗(1例肾上腺转移给予转移灶切除，2例肺转移给予分子靶向治疗)，治疗后CTCs数量及间质型比例较治疗前呈下降趋势；2例因患者原因未接受治疗，CTCs总数及间质型CTC比例均呈进展趋势。

2.3 分子靶向治疗对CTCs数量及分型的作用16例CTCs呈进展趋势的患者中，11例未予干预，8例患者CTCs继续进展。5例患者给予索拉菲尼分子靶向治疗(2例为晚期治疗，3例为术后辅助)，治疗后检测CTCs数量及间质型CTCs比例较治疗前均呈下降趋势(27.00±8.74vs.11.40±2.07；0.81±0.02vs.0.33±0.05)。靶向治疗组CTCs呈现下降趋势的患者比例高于未治疗组(表2)。

表2 靶向治疗与CTCs分型检测结果[例(%)]

3 讨 论

对肾癌的进展早发现早治疗，并对治疗效果进行实时、有效的评价意义重大[6]。目前肾癌监测手段主要靠影像学检查，但影像学检查对肾癌的进展及疗效判断具有滞后性，肿瘤体积发生一定变化后才会被影像学发现，不利于治疗效果的及时评价。寻找一种能够在治疗过程中对肿瘤进行重复监测，实时了解肿瘤治疗效果及进展风险的检查手段，对肾癌的治疗至关重要。

研究发现，CTCs与乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的转移和复发显著相关[3]。CTCs检查仅需抽取少量外周血，具有取样简单、可重复性强、无创等诸多优点，对早期发现肿瘤微转移、评估预后和疗效以及肿瘤的个体化治疗具有重要意义[7]。在无法通过现有诊断模式如CT和PET-CT发现远处转移的患者中，约20%的患者可检测到CTCs，CTCs检测可以比CT、PET更早、更有效地诊断肿瘤复发和转移[8]。肾癌方面，我们前期研究发现CTCs数量及间质型CTCs比例的增加趋势与肾癌的进展转移具有显著相关性[5]。

一些研究发现，CTCs数量检测可评价肿瘤治疗效果。结直肠癌根治术后CTCs数量继续增加，则提示肿瘤复发转移的危险性增加[9]。对接受化疗的进展期结直肠癌患者研究发现，通过CTCs检测，可以有效地预测患者的OS[10]。在前列腺癌研究中发现，与PSA检测相比，CTCs能够更早地预测患者从治疗中的获益程度，在治疗的第2～5周PSA尚未有显著变化时，CTCs数量就出现具有统计学差异的变化，提示CTCs数量检测是早期，敏感的疗效评价指标。其次，通过ROC曲线对比CTCs数量和PSA的预测准确性，发现CTCs数量对治疗效果的预测准确性要比PSA更有优势[11]。

但在一些研究中发现，单纯的CTCs数量变化与治疗后疾病转归并不相符，CTCs分型检测中间质型CTCs的比例变化也同样重要。发表在Science上的一篇针对乳腺癌的研究发现，在接受治疗的肿瘤缓解病例中，仍有部分患者CTCs数量呈现上升趋势，另有一些患者即使治疗后CTCs数量呈现下降趋势，但疾病仍出现临床进展[12]。出现这种结果的原因是CTCs在形成过程中伴随着上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，使得外周血循环肿瘤细胞包含上皮型、间质型和上皮/间质混合型的三种类型，与上皮型CTCs相比，间质型CTCs具有更强的侵袭转移能力，在肿瘤的转移过程同样起主要作用[13-15]。因此，仅仅依靠CTCs的数量不能准确评估肿瘤进展风险，还需要结合CTCs分型，即间质型CTCs的数量和比例来综合评估。上述乳腺癌研究中治疗后肿瘤进展病例中，虽然CTCs数量降低，但间质型细胞比例出现了增加；疾病缓解的病例中，虽然有CTCs数量的增加，但间质型细胞的比例却呈下降趋势，提示间质型CTCs比例的增高与乳腺癌预后呈负相关性[12]。因此，本研究在CTCs结果认定中，认为CTCs的进展或下降不仅表现为CTCs数量的增加或减少还应同时包括间质型CTCs比例的增高或降低。CTCs数量与间质型细胞比例出现相反趋势时，则认为趋势待定，需继续严密监测CTCs变化。本研究入组的5例转移性肾癌患者，2例未予治疗，3例给予转移灶切除或分子靶向治疗，其CTCs数量及间质型CTCs比例的变化趋势与肿瘤预后的关系，证实了CTCs检测是评价晚期肾癌治疗的有效方法。

CTCs数量及分型检测是否可以作为实时监测治疗效果的手段，是评价CTCs检测临床价值的另一重要因素。研究认为，CTCs检测对乳腺癌的治疗具有实时监测作用[12]。我们研究中的2例治疗转归颇为复杂的转移性肾癌个案，1例发生2次远处转移，1例进行2次靶向治疗。其CTCs检测的变化趋势与临床治疗转归一致，且CTCs检测均比影像学提早发现疾病的变化趋势，证实了CTCs检测对肾癌治疗的评价更具有早期、灵敏的优势。

分子靶向治疗对肾癌CTCs作用的研究文献不多。MUSELLA等[16]对结直肠癌患者应用西妥昔单抗、帕尼单抗靶向治疗并进行CTCs检测发现，治疗后CTCs阴性的患者比阳性者具有更长的无进展生存期。本研究发现，16例CTCs进展趋势的患者中，5例给予分子靶向治疗，其中2例属于转移性肾癌治疗用药，3例属于未转移的辅助靶向治疗，治疗后CTCs均呈显著下降的趋势。11例未予干预治疗，其中8例患者CTCs呈现进展趋势，靶向治疗组CTCs呈现下降的患者比例高于未治疗组。说明分子靶向治疗具有降低肾癌患者CTCs数量及间质型CTCs比例的作用。

综上，我们认为CTCs具有评价肾癌治疗效果的作用，CTCs数量及间质型细胞比例的下降与治疗有效相关。分子靶向治疗具有降低肾癌CTCs数量及间质型CTCs比例的作用。CTCs分型检测具有早期、灵敏的优势，可以作为实时监测治疗效果及疾病进展的手段。但本课题分子靶向治疗的例数较少，结果难免存在偏差，有待选取更大样本量进一步验证。

致谢：感谢辉瑞医学部宋旸博士给予的文献支持!