HPLC法测定清咽利喉合剂中黄芩苷的含量

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清咽利喉合剂是曲靖市第一人民医院研制的院内制剂。由黄芩、金荞麦、玄参、麦冬等组成，具有养阴、清咽、清热解毒的功效，临床用于咽喉肿痛、急性扁桃体炎、咽颊炎、上呼吸道感染等症。其中黄芩为制剂中的君药，有着悠久的应用历史，始载于《神农本草经》，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1]。《本草正》中记载：“枯者清上焦之火，消痰利气，定喘咳……，解瘟疫，清咽，疗肺萎……”，临床上主要用于肺热咳嗽、痈肿疮毒，咽喉肿痛等症。黄芩苷是从黄芩中提取分离出来的一种黄酮类化合物，已证明有广泛的药理活性，具有消炎、解热、抗病毒、抗菌等作用[1-2]。2015版《中国药典》将黄芩苷作为黄芩的质量控制指标[3]。结合《中国药典》和文献[4-8]，通过对清咽利喉合剂中君药黄芩的有效成分黄芩苷进行含量测定，从而达到对该药的质量控制。实验采用高效液相色谱法测定清咽利喉合剂中黄芩苷含量，操作简单，准确性高，为有效控制清咽利喉合剂质量提供可靠且简便易行的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(包括高压四元泵、DAD检测器、柱温箱、自动进样器、工作站)；超声波清洗器(上海声源超声波清洗器设备有限公司)；ME104万分之一电子分析天平、ME55十万分之一电子分析天平。

1.2 材料 黄芩苷对照品(批号：110715-201318，中国食品药品检定研究院，含量为93.3%)；清咽利喉合剂(批号：20190127-1、20190326-2、2019012-2，曲靖市第一人民医院制剂室)，甲醇(分析纯，批号：127848，赛默飞世尔科技有限公司)，乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品 1.55 mg，精密称定，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成浓度为0.05785 mg/mL 对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取清咽利喉合剂2.0 mL，置50 mL 量瓶中，加50%乙醇35 mL，超声处理30 min，放冷至室温，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取此液5.0 mL，置25 mL 量瓶中，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液经0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按清咽利喉合剂的处方比例，分别称取除黄芩以外的其他药材，依照清咽利喉合剂工艺制备不含黄芩的阴性样品，并按“2.1.2”项下制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸(32∶68)，检测波长为326 nm，流速1.0 mL /min，柱温30 ℃。

2.3 线性关系考察 按“2.2”色谱条件分别进样1、3、5、7、10、15 μL进行测定，以黄芩苷的进样质量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得到黄芩苷的回归方程为Y=1808.8865*Amt+14.1250,相关系数为0.99970。

2.4 精密度 精密吸取清咽利喉合剂(批号：20181214-1)供试品溶液10 μL，按“2.2”色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，结果峰面积的RSD%为0.12%，表明仪器的精密度良好。

2.5 专属性 将阴性样品溶液按 “2.2”项下色谱条件进行分析，结果见图1，在与样品主峰保留时间处未出现相应的色谱峰。

2.6 稳定性试验 精密量取清咽利喉合剂(批号：20181214-1)5.00 mL，置50 mL 量瓶中，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定，记录黄芩苷色谱峰的面积，结果峰面积的RSD为0.35%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密量取清咽利喉合剂(批号：20181214-1)5.00 mL，置50 mL 量瓶中，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按“2.2”色谱条件测定，测定黄芩苷的峰面积，计算黄芩苷的平均含量为2.663 mg/mL，RSD为0.49%，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验 精密量取清咽利喉合剂(批号：20190127-1)1.0 mL，置50 mL 量瓶中，共6份，分成三组，每组分别依次精密加入黄芩苷0.05785 mg/mL 的对照品溶液1.0、2.0、3.0 mL，照“2.2”项下方法制备供试品溶液，滤过，取续滤液，经0.4 μm滤膜滤过即得。按“2.3”色谱条件，精密吸取6份供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录黄芩苷峰面积，按外标法计算黄芩苷的含量，并计算回收率。平均回收率为99.9%，RSD为0.62%，回收率良好，符合分析方法的要求。回收率结果见表1。

表1 回收率测定结果

2.9 样品含量测定 精密量取3批清咽利喉合剂(批号：20181214-1、20181207-1、20190110-1)5.00 mL，置50 mL 量瓶中，每批次平行操作2份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件测定，外标法计算各供试品溶液中黄芩苷的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 参照《中国药典》2015年版中黄芩含量测定，甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸为流动相，检测波长为326 nm，流速1.0 mL /min，柱温30 ℃，结果表明，以乙腈-0.1%磷酸为流动相的供试品色谱峰分离度较好，达到基线分离。

3.2 提取溶剂和提取方法 分别考察了超声提取法和回流提取法两种提取方法及不同提取溶剂(甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇)，结果表明，超声提取效率较水浴加热回流高，其中提取效率50%乙醇>甲醇>70%乙醇>乙醇。因此采用50%乙醇作为提取溶剂，超声处理的方法，该操作方法简单易行，且主峰和杂质峰分离较好。

3.3 提取时间的考察 精密量取清咽利喉合剂2.00 mL，3份，置50 mL 量瓶中，加入35 mL 50%乙醇，分别超声处理20、30、40 min，结果表明，该样品中黄芩苷的含量经超声处理30 min可提取完全。

综上所述，实验采用高效液相色谱法测定清咽利喉合剂中黄芩苷的含量，操作简单，精密度高，稳定性好，可以作为本制剂的监控指标，更好的控制该制剂的质量。