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一个大豆矮秆性状基因的分子标记定位

2019-10-14冯凡育

北京农学院学报 2019年3期
关键词:矮秆连锁引物

袁 鹰,王 程,韩 俊,张 鑫,仝 潇,冯凡育,谢 皓

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京 102206)

株高对作物生长的群体结构和产量来说是很重要的农艺性状[1]。近年来,随着分子生物学和基因组学的飞速发展,对作物高产性状、高产机理及其相关基因的研究愈加深入,培育理想株型已成为作物育种的重要目标[2]。合理株型是高产品种的生育基础和形态特征,其中矮秆是理想株型的一个重要性状[3],矮秆基因的利用对于20世纪“绿色革命”起到决定性作用[4]。例如,将大豆中抗倒伏的有限结荚习性基因dt1转育到无限结荚习性的北方高产品种中,育成Elf、Sprite、Hobbit、Gnome等半矮秆品种,在高产环境下采取高密度种植实现超高产,并得到大面积推广应用[5]。

前人曾用传统的统计分析方法研究大豆株高的遗传规律,认为株高是多基因控制的数量性状,遗传力较高,受1~2对主效基因和微效多基因控制[6-7],陈恒鹤等[8]研究指出“矮源矬”的株高性状受1对隐性主效基因和多个修饰基因共同控制,而Kilen等研究表明大豆品种PI227224的矮秆性状是由单个隐性基因控制[9-10]。Hwang等[11]在辐照大豆种子的快速鉴定中得到1个矮秆突变体,通过全基因组关联分析表明,存在1个803 bp的缺失区域可能与矮秆表现型相关。Cheng等[12]用γ射线诱变M2群体大豆得到2个都是隐性遗传方式的突变体Gmdwf1和Gmdwf2。Li等[13]用EMS诱变大豆栽培品种中品661,得到1对隐性核基因控制能明显降低株高和缩短茎节尖的DW突变体。

本课题组在育种工作中,利用海系13为母本与父本北农103杂交,在(海系13×北农103)F4部分剩余杂合体分离群体(RHL)中发现高秆/矮秆性状分离明显。北农103为北京市审定的夏播品种,从中黄18种子60Co-γ辐照的衍生后代选育而成,而中黄18的杂交组合为中品661×Century-2。Century-2是优良品种Century(不含脂肪氧化酶-Lox)的近等基因系,推测分离后代中的矮源可能来自Century-2,而对Century-2和Century株高方面的研究尚无报道。

本研究拟通过对(海系13×北农103)F4RHL的F2高秆/矮秆分离群体的遗传分析,解析高秆/矮秆性状的遗传规律,并利用F2∶3分离群体对其中北农103中控制矮秆RHL性状的基因进行分子标记与定位,为该基因精细定位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1套(海系13×北农103)F4RHL的F2分离群体,由北京农学院大豆课题组选育。其中,海系13为南京菜用春大豆品种,株高90 cm;北农103为北京市审定的夏播品种,株高55 cm;F2分离群体中高株平均90 cm,矮株平均35 cm。SSR引物,由北京鼎国昌盛有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 高秆/矮秆分离群体鉴定与遗传分析 在大豆鼓粒期对(海系13×北农103)F4RHL的F1和F2代高秆/矮秆田间鉴定,并对F2中表现高秆/矮秆分离株系的鉴定结果进行卡方检验。

1.2.2 大豆基因组DNA提取及分子标记 采用CTAB法对(海系13×北农103)F4RHL中F2∶3群体的单株叶片进行基因组DNA的提取。采用BSA法,根据田间调查结果,分别用F2∶3群体中6个高秆和6个矮秆单株构建DNA高秆池和矮秆池,初步筛选控制矮秆基因的分子标记;利用(海系13×北农103)F4RHL中F2∶3群体对初选标记进行验证。

1.2.3 PCR扩增与电泳 用Bio-Rad PCR仪进行扩增。PCR反应体系为10 μL,包括正向引物0.5 μL(0.2 μm/L),反向引物0.5 μL(0.2 μm/L),PCR Mix 5 μL,DNA模板2 μL(15~25 ng/μL),ddH2O 2 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环,最后72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=39∶1)电泳的方法进行检测。点样量为1.8 μL,150 V电泳1.5~2 h。采用快速银染法染色显带,照相后统计带型。

1.2.4 数据分析和遗传作图 将统计的带型用Mapmaker3.0软件(LOD值取3.0)计算筛选出的分子标记与矮秆基因间遗传距离;采用MapDrawV2.1软件构建遗传连锁图谱;参照大豆遗传连锁图谱(www.soybase.org)进行基因定位。

2 结果与分析

2.1 高秆/矮秆大豆表型性状的遗传分析

注:左为高秆植株,右为矮秆植株。Note:Left is tall plant, Right is dwarf plant.图1 (海系13×北农103)F4RHL的F2株高分离表现Fig.1 (HaiXi 13×BeiNong 103) F2 of F4RHL plant height separation performance

2.2 GmD1基因SSR标记的筛选

以大豆(海系13×北农103)F4RHL的F2分离群体为分析材料,从中各选取6个髙秆单株和6个 矮秆单株,采用BSA法,建立高秆和矮秆2个近等基因池,利用大豆630对SSR引物进行PCR扩增,在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中,分析筛选2个近等基因池间具有多态性的SSR引物。经多次PCR筛选,在630对SSR引物中,获得25对具有多态性的引物,占总引物的4%,扩增产物表现出2~3条电泳谱带,在150~300 bp之间。在此基础上,利用RHLF2高矮秆分离材料中的30个髙秆和30个矮秆单株,继续对25对引物的扩增结果进行验证,发现在25对引物中,9个引物所产生标记与GmD1具有连锁关系,分别为Satt527,Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664。为进一步分析这9对引物产生的标记与GmD1的连锁距离,以(海系13×北农103)RHLF2分离群体共201个单株进行PCR检测,其中高秆139个,矮秆62个。检测结果表明,9个SSR引物(表1)扩增产生标记均与矮秆基因GmD1紧密连锁(表2),其中3对引物的PCR结果见图2。

表1 SSR引物序列Tab.1 The SSR primer for analysis

表2 9个SSR标记对(海系13×北农103)RHLF2的检测结果和与GmD1的遗传距离Tab.2 Analysised results of HaiXi13×BeiNong103 RHLF2 by 9 SSR markers and genetic distance of GmD1

注:A为高秆纯合型;B为矮秆纯合型;H为杂合带型。

Note:A is high plant homozygous genotype; B is dwarf plant homozygous genotype; H is heterozygous genotype.

注:M是标记,1是海系13,2 是北农103,3-17是矮秆单株,18-32是高秆单株;箭头指示标记位置。Note: M is Maker, 1 is Haixi13, 2 is BeiNong103, 3-17 are Dwarf individuals, 18-32 are High individuals; The arrows indicated the SSR markers .图2 标记Satt481(A)、Sat_245(B)和Sat_150(C)的PCR结果Fig.2 PCR bySatt481(A), Sat_245(B) and Sat_150(C)

2.3 GmD1基因遗传连锁图谱的构建

利用Mapmaker3.0连锁分析软件对表1中的9对SSR引物在(海系13×北农103)RHLF2分离群体中的201个单株所产生的分子标记与矮秆基因GmD1进行连锁分析,并绘制遗传连锁图谱。结果表明:SSR标记Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664与GmD1的遗传距离分别为3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM,从遗传连锁图谱(图3)上可以看出GmD1位于satt166与satt527之间,与9个标记的连锁位置为Satt664-Satt229-Sat_245-Sat_150-Satt481-Sat_340-Satt527-GmD1-Satt166-Satt076。通过对公布的大豆遗传连锁图谱(www.soybase.org)上SSR位点分析,这9个SSR标记均在大豆L连锁群上,故GmD1基因也在L连锁群上,对应大豆第19号染色体。

3 讨 论

本研究利用(海系13×北农103)F4RHL的F2髙秆和矮秆植株构建的分离群体,对其矮秆植株携带的矮秆基因进行遗传分析。矮秆性状受1对隐性基因控制,暂命名为GmD1。进而利用SSR分子标记结合BSA方法对GmD1进行遗传连锁分析,筛选出9个与GmD1连锁的SSR标记,分别为Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664,经Mapmaker3.0软件连锁分析,与GmD1的遗传距离分别为3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM。依据公布的大豆遗传连锁图谱上SSR标记位点分析,GmD1位于大豆L连锁群上,对应大豆第19号染色体。

图3 大豆矮秆基因GmD1遗传连锁图Fig.3 Genetic linkage map of soybean dwarf gene GmD1

通过对海系13×北农103杂交组合的亲本株高的表现和系谱分析,GmD1来源于北农103,而北农103从中黄18种子60Co-γ辐照的衍生后代选育而成,中黄18的杂交组合为中品661×Century-2。Li等[13]用EMS诱变大豆品种中品661,得到1个能明显降低株高和缩短茎节尖的DW突变体,认为该突变体是由1对隐性核基因控制,定位在大豆8号染色体的460 kb区域。本研究发现该突变体基因与本研究发现的GmD1不在同一连锁群(染色体)上,并非同一基因。推测GmD1可能是一个新的矮秆基因。

尽管目前关于大豆矮秆基因的研究有所报道,但发现的矮秆基因依然较少,本研究对GmD1的发现,丰富大豆矮秆基因的类型,同时获得多个与GmD1紧密连锁的分子标记,为该基因的精细定位和利用奠定基础。

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