紫叶稠李叶片对低温环境的生理响应

蔡建超，覃银朴，马 赫，崔金腾,2,3*，赵和文*

(1.北京农学院园林学院，北京102206；2.城乡生态环境北京实验室，北京102206；3.北京市乡村景观规划设计工程技术研究中心，北京102206)

紫叶稠李(Prunusvirginiana)为蔷薇科稠李属高大落叶乔木，株高可达10 m以上[1]，紫叶稠李初生叶为绿色，进入4月后随着温度升高，逐渐转为红绿色至紫红色，秋后变成红色，是观赏价值较高的彩叶树种[2]。其适应性、耐旱性、抗寒性强，且喜光、速生。可以通过播种、嫁接和扦插繁殖，以嫁接成功率最高。经苗木生产者引种栽培，在北方广大地区已突显其彩叶树种的优良特性[3-4]。目前，一些关于紫叶稠李耐寒性的报道多是通过引种地栽培的紫叶稠李生物学特性及生长表现的观察定性描述[5]。杨艳清[1]进行长春市引种紫叶稠李的生物学特性、生态学特性、生长节律及繁殖技术等研究。王秀兰[6]研究引入沈阳的紫叶稠李小苗生物学特性、物候期、繁殖技术等方面的试验。紫叶稠李具有较强的耐寒性，本试验对紫叶稠李进行低温处理，研究低温对花色素苷、叶绿素、类胡萝卜素和可溶性糖积累的影响，以及相关酶活性变化规律，同时为低温环境下紫叶稠李叶色变化的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取种植于北京农学院园林学院园林植物实践基地的二年生紫叶稠李扦插苗。

1.2 低温处理

5月初将绿叶期的紫叶稠李放于园林楼植物培养间，温度15 ℃，光照强度15 000～20 000 lx，光照时间14 h光/10 h暗，分别于0、7、14、21、28、35、42 d采集枝条中部的叶片作为试验材料，设置5次重复；在园林植物实践基地放置5盆常温生长，光强相同的对照，其间对材料定期除草、浇水、施肥，保证长势良好。

1.3 叶色参数测定

叶色参数测定采用柯尼卡美能达(中国)投资公司的色彩色差计(CR-400/410)，L*表示照度，相当于亮度，a*表示从洋红色至绿色的范围，b*表示从黄色至蓝色的范围。L*的值域由0到100，表示由黑色向白色转变。a*和b*的值域都是由-127至+128，由负值到正值，a*表示由绿色向红色转变；同样原理，b*表示由蓝色向黄色转变，所有颜色就以这三个值交互变化组成。

1.4 色素含量测定

花色素苷采用盐酸提取比色法测定，准确称取植物样品0.50 g，置于具塞试管中，加0.1 mol/L盐酸溶液20 mL，使样品完全浸于溶液中，加塞，置于32 ℃恒温箱中浸提4～8 h，取上清液装入光径1 cm的比色皿中，以0.1 mol/L盐酸为空白对照，测量波长为530 nm的吸光值。叶绿素、类胡萝卜素采用乙醇提取比色法测定，准确称取植物样品0.20 g，放入研钵中，加少量石英砂和95%乙醇3 mL，研磨成匀浆，过滤到25 mL棕色容量瓶中，定容，取提液装入光径1 cm的比色皿中，以95%乙醇为空白对照，测量波长为470、649、665 nm的吸光值。设5次生物学重复。

1.5 酶活性和可溶性糖测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法测定[7]，称0.5 g样品，加1 mL磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH=7.8)，冰浴研磨，研磨后加1 mL缓冲液，倒入离心管中，用2 mL缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温(0～4 ℃)离心20 min，离心后冷藏保存。取型号相同的试管，试管中加50 μL上清液(2支对照试管中各加磷酸缓冲液50 μL)，分别加3 mL反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4 000 lx日光下反应20～30 min(要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低温时延长)。反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560 nm下比色测定吸光度值。

过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[8]，取0.5 g样品，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。过氧化物酶活性测定的反应体系：依次加入2.9 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液；1.0 mL 2% H2O2；1.0 mL 0.05 mol/L愈创木酚和0.1 mL酶液。用加热煮沸5 min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34 ℃水浴中保温3 min，然后迅速稀释1倍，470 nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度A470，共记录5次。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)(A137)和多酚氧化酶(PPO)(A136)这2种酶活性采用南京建成生产的试剂盒测定。

可溶性糖含量(A145)采用南京建成生产的试剂盒测定。

1.6 数据分析

采用Excel软件进行数据处理和作图，用SPSS 17.0(One-Way ANOVA)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 低温对紫叶稠李叶色参数的影响

对低温处理环境下的紫叶稠李进行叶色参数测定，叶色参数L*、a*、b*变化情况反映出叶色从低温处理开始由绿变紫过程(图1)。由图2可知，L*值逐渐减小，减少了15.6，低温处理0 d与处理42 d差异显著；a*值从负到正，增加了17.3，处理0 d与处理42 d差异显著；b*值逐渐减小，减少了21.3，处理0 d与处理42 d差异显著。

注： A表示处理0 d，B表示低温处理21 d，C表示低温处理42 d。Note: A is 0 days of treatment, B is 21 days of low temperature treatment and C is 42 days of low temperature treatment.图1 低温处理下紫叶稠李的叶色变化Fig.1 Changes of leaf color in Prunus virginiana under low temperature treatment

图2 低温处理下的紫叶稠李叶色参数变化Fig.2 Leaf color parameters in Prunus virginiana under low temperature treatment

2.2 低温对紫叶稠李叶片色素含量的影响

低温处理后，紫叶稠李各色素含量变化趋势见图3。花色素苷含量前期增长缓慢，后期增长较快，虽在21 d时略有下降，但总体呈增长趋势，增长了约19倍。叶绿素a、叶绿素b、叶绿素ab、类胡萝卜素含量0至14 d时增长较快，之后增长缓慢，趋于平稳，但在叶色变化过程中仍呈增长趋势，都增长了约1.5倍。

2.3 低温对紫叶稠李叶片酶活性和可溶性糖的影响

对低温处理后紫叶稠李酶活性的影响见图4。超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性随时间增加呈先下降后上升再下降的变化趋势，分别下降了70%和55%；过氧化物酶活性与两者相反，呈先上升后下降再上升的变化趋势，增加了约7.5倍；苯丙氨酸解氨酶活性变化趋势与前者三个酶活性都不同，呈现先下降后上升的变化过程，稍有下降；代谢产物可溶性糖则一直处于上升的变化趋势，增加了约12倍。

2.4 低温处理与自然环境下紫叶稠李各种生理生化分析

对低温处理与自然环境下紫叶稠李各种生理生化分析见表1。在0.01和0.05水平下，低温处理植株叶色参数(L*、a*、b*)与自然环境植株差异不显著，与对照植株差异显著；低温处理植株花色素苷含量显著增加，增加了约3倍，与自然环境植株有显著差异，与对照植株差异显著；低温处理植株叶绿素和类胡萝卜素含量显著增加，分别增加了约1.5倍和1倍，与自然环境植株显著差异。在0.01水平下，自然环境植株的叶绿素b与对照植株差异不显著。

低温处理紫叶稠李植株的过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性与自然环境植株相比有显著差异，其中过氧化物酶活性显著高于自然环境植株和对照植株，是自然环境植株的34倍，是对照植株的7.5倍；多酚氧化酶活性显著低于自然环境植株和对照植株，仅为自然环境植株的26%，与自然环境植株相比超氧化物歧化酶活性差异不显著，且活性均显著低于对照植株；可溶性糖含量显著高于自然环境植株，约是自然环境植株的16倍。

2.5 低温处理下紫叶稠李叶色参数、色素、酶活性相关性分析

低温处理下紫叶稠李叶色参数、色素、酶活性相关性分析见表2。在0.05水平下，花色素苷与L*呈显著负相关，与a*和叶绿素b呈显著正相关；叶绿素a与a*、过氧化物酶、可溶性糖呈显著正相关，与苯丙氨酸解氨酶呈显著负相关；叶绿素b与类胡萝卜素、过氧化物酶呈显著正相关；叶绿素ab与a*、过氧化物酶、可溶性糖呈显著正相关，与苯丙氨酸解氨酶呈显著负相关；类胡萝卜素与L*、b*、苯丙氨酸解氨酶呈显著负相关。在0.01水平下，叶绿素a与L*、b*呈极显著负相关，与类胡萝卜素呈极显著正相关；叶绿素b与可溶性糖呈极显著正相关。

图3 低温处理下紫叶稠李叶片色素含量的变化Fig.3 Changes of pigment accumulation in Prunus virginiana under low temperature treatment

图4 低温对紫叶稠李的酶活性和代谢产物的影响Fig.4 Effects of low temperature on enzyme activity and metabolites of Prunus virginiana

表1 低温处理与自然环境下紫叶稠李各种生理生化指标分析Tab.1 Physiological and biochemical analysis of Prunus virginiana under low temperature and natural environment

注：表中数据后大写字母表示显著性水平为0.01，小写字母表示显著性水平为0.05；CK表示处理0 d，T1表示低温处理42 d，T2表示自然环境生长42 d。

Note：The capital letters of the table indicate that the significance level was 0.01, and that of lowercase letters was 0.05；CK means 0 days of treatment, T1 means 42 days of low temperature treatment and T2 means 42 days of growth in natural environment.

表2 低温处理下紫叶稠李酶活性以及色素的相关性分析Tab.2 Correlation analysis of enzymes activities and pigments in Prunus virginiana under low temperature treatment

注：*表示在0.05水平呈显著相关性，**表示在0.01水平呈显著相关性。

Note： * indicates a significant correlation at the 0.05 level, ** indicates a significant correlation at the 0.01 level.

3 讨 论

温度是影响植物生长发育重要的因子之一，在植物生长发育过程中的某些环节起着决定性的作用。目前，通过大量的试验研究人们对有关植物的抗寒性生理指标及耐寒性机理有一定的认识，植物经过低温胁迫后相对电导率、丙二醛含量、脯氨酸、花色素苷和各种酶活性均发生不同程度的变化，改变植物在逆境(如强光和紫外线、干旱、低温等)的抗逆性和防御性[9-11]。

本研究以紫叶稠李为试验材料，对低温环境下叶色参数以及叶绿素、类胡萝卜素和花色素苷含量的变化进行分析。付全娟等[11]研究花色素苷在果树抗逆中的作用，发现花色素苷的合成和积累有利于提高果树的抗低温能力，刘国君等[12]研究花色素苷含量与苹果抗寒性的关系，发现抗寒性强的品种枝条中花色素苷含量高。本研究表明紫叶稠李低温处理后随着时间的增加花色素苷含量呈增加趋势，花色素苷含量显著高于对照植株，与前人研究结果一致。曾乃燕等[13]对水稻低温胁迫光合色素的影响研究，得出低温使光合色素含量降低。本研究表明叶绿素和类胡萝卜素在低温条件下含量升高，与前人的结果不一致，这可能由于物种不同导致。花色素苷的含量与叶绿素、类胡萝卜素含量呈正相关，且与叶绿素b含量呈显著正相关，表明花色素苷、叶绿素、类胡萝卜素的积累提高紫叶稠李的抗寒能力，进而调控紫叶稠李叶色变化。石进朝等[14]研究发现，金银木叶片内可溶性糖含量随着温度降低而逐渐增加，姚小红等[15]对彩叶扶桑叶色生理变化影响的分析发现，可溶性糖与花色素苷呈正相关。本研究通过对低温处理和自然环境中紫叶稠李可溶性糖含量分析显示紫叶稠李花色素苷合成与可溶性糖含量是显著正相关，表明在花色素苷积累的过程中伴随着可溶性糖的积累。

有研究结果证明，超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性与植物的抗寒性也有密切的关系[16-18]，对活性氧有清除作用，可维持活性氧动态平衡，增强植物的抗逆性[19-21]。在低温胁迫条件下超氧化物歧化酶对低温的反应较敏感，低温胁迫强度较低时表现出较高的酶活性[22-23]。在较低强度(15 ℃)低温处理条件下紫叶稠李，除多酚氧化酶外，超氧化物歧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性都要高于自然环境条件下的酶活性，说明在低温胁迫强度较低的情况下大部分酶能表现出较高的活性，和前人的研究结果一致，超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性增加可以增强紫叶稠李的抗逆性。刘鹏等[24]对低温胁迫下外源水杨酸对栝楼幼苗抗寒性影响研究发现，低温使多酚氧化酶活性增加。而本研究表明紫叶稠李在低温胁迫下多酚氧化酶活性降低，与上述结果不一致，可能紫叶稠李存在特有的调控机制，具体原因有待进一步研究。本试验结果表明，紫叶稠李在低温下体内色素积累增加，可溶性糖含量升高，抗氧化酶等活性提高，一方面提高抗寒性，另一方面叶色发生变化，提高观赏性。

紫叶稠李是一种有较强耐寒性的高大彩叶乔木，低温并不影响其观赏性，因此是北京增彩延绿工程的重要选材之一。本研究通过在模拟低温环境分析紫叶稠李的耐寒适应性以及同时期叶色变化规律，从生理生化变化机制角度对低温和叶色调控机制之间的相互关系进行分析，为今后提高紫叶稠李的引种适用性和观赏性应用提供理论依据。