瞬时受体电位锚蛋白-1对应激诱导的大鼠回肠黏膜损伤的影响

徐岩 郄文斌 吴友平 屠伟峰

1第七十四集团军医院麻醉科（广东惠州 516008）；2南部战区总医院麻醉科（广州 510000）

过度应激，如严重烧伤、创伤和重大手术等情况均可引起肠黏膜不同程度的损伤，严重影响患者的康复，然而目前尚无有效的防治手段。瞬时受体电位锚蛋白-1（transient receptor potential ankyrin-1，TRPA1）丰富表达于肠上皮细胞、肠嗜铬细胞、肥大细胞和肠肌间神经丛以及支配肠的初级传入神经元和其细胞体所在的相应阶段的背根神经节。前期研究证明结肠内给予TRPA1的特异性激动剂2，4，6-三硝基苯磺酸或芥子油可引起严重的结肠炎，这和感觉神经元上TRPA1的激活密切相关［1］。因此本研究在应激前给大鼠腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-030031，进一步阐明TRPA1在应激性肠黏膜损伤中的作用，为临床有效预防肠黏膜损伤和促进肠道功能恢复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料雄性Wistar大鼠体质量（200±20）g，南部战区总医院动物实验室提供。实验前禁食12 h，自由饮水。

1.2研究方法

1.2.1实验分组与制备动物模型大鼠24只随机分为4组（n=6）：正常对照组（NC组）、WIRS回肠黏膜损伤模型组（WC组）、HCL组和HC2组。后3组放入鼠笼内，置（19±1）℃水中，水面平剑突。HC1组和HC2组于浸水束缚应激（water immersion restraint stress，WIRS）前1 h腹腔注射HC-030031（Sigma），剂量分别为100和200 mg/kg。WIRS 6 h后麻醉，取背根神经节（DRG）（T10-12）和回肠组织。

1.2.2 RT-PCR检测DRG中TRPA1的mRNA表达Trizol提取总RNA后M-MLV反转录试剂合成cDNA。最后SYBR Premix Ex TaqⅡkit进行RTPCR。所用引物见表1。

表1 TRPA1和β-ACTIN实时荧光定量PCR引物Tab.1 RT-PCR primers for TRPA1 and β-actin

1.2.3Western Blot检测回肠组织中TRPA1蛋白表达100 mg回肠组织加入500 μL RIPA裂解液，匀浆后冰上反应30 min，离心后取上清液。根据BCA法测定蛋白浓度。上样，再经电泳、转膜、封闭、一抗（TRPA1浓度1∶1 000）4℃孵育过夜、HRP二抗标记，ECL法曝光，Image J软件进行目的条带灰度值分析。

1.2.4免疫组织化学法检测DRG和回肠组织中TRPA1的表达切片脱蜡至水-柠檬酸抗原修复-3%H2O2阻断内源性过氧化物酶-血清封闭、一抗（TRPA1浓度1∶400）4℃孵育过夜-二抗孵育1 h、DAB显色、苏木素复染。显微镜下观察切片并拍照、Image-Pro Plus测OD值。

1.2.5回肠组织HE染色切片脱蜡至水，苏木素-伊红染色。显微镜下观察各组切片并拍照、评分，评分标准参照［2］，评分越高，损伤越严重。

1.3统计学方法应用SPSS 21.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，采用两独立样本t检验或者one-way ANOVA。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1回肠黏膜病理损伤及评分NC组：肠黏膜形态正常。WC组：肠黏膜表层（约占黏膜全层的1/2）广泛液化坏死、细胞剥脱，可见广泛出血。部分区域黏膜层完全坏死，残留黏膜固有层间质毛细血管充血明显；部分区域黏膜表层剥脱，表层上皮细胞与固有层明显分离。局部黏膜层中淋巴滤泡高度反应性增生，生发中心明显。与NC组比较，WC组肠黏膜损伤严重，评分明显增高（P＜0.001）；与WC组比较，HC1组和HC2组肠黏膜损伤情况明显好转，评分明显降低（P＜0.01）；且HC2组比HC1组损伤评分更低（P＜0.01）。见图1。

图1 HC-030031减轻WIRS诱导的回肠黏膜损伤病理学图像Fig.1 Pathological images of HC-030031 alleviated WIRS-induced IML

2.2 DRG中TRPA1的mRNA表达与NC组相比，WC组DRG中TRPA1 mRNA表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图2。

2.3DRG中TRPA1蛋白表达与NC组相比，WC组DRG中TRPA1蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图3。

图2 WIRS诱导DRG中TRPA1的mRNA表达上调Fig.2 WIRS up-regulation TRPA1 mRNA expression in DRG

图3 WIRS诱导DRG中TRPA1蛋白表达上调Fig.3 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in DRG

2.4回肠中TRPA1的蛋白表达与NC组比较，WC组回肠中TRPA1蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图4。

2.5回肠组织中TRPA1蛋白表达与NC组相比，WC组回肠组织中TRPA1蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.001），见图5。

3 讨论

图4 WIRS诱导回肠组织中TRPA1蛋白表达上调（WB）Fig.4 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in ileal（WB）

图5 WIRS诱导回肠组织中TRPA1蛋白表达上调（免疫组化）Fig.5 WIRS up-regulation TRPA1 protein expression in ileal（IHC）

TRPA1是与温度、机械或化学刺激有关的非选择性阳离子钙通道，胞质内Ca2+是通道门控的重要调节因子。大量研究［3］表明TRPA1在急慢性疼痛、咳嗽和多种炎性疾病的发生发展中起重要作用。但是，TRPA1在应激性回肠黏膜损伤中的作用国内外尚未见报道，因此本文对此进行研究。笔者的免疫组织化学结果证实TRPA1在回肠和支配回肠相应阶段的DRG（T10-12）有丰富表达。NOZAWA等［4］也报道，通过RT-PCR检测，与其他器官相比，TRPA1在大鼠的小肠中mRNA表达水平最高，这些都决定了TRPA1在调控小肠的运动、分泌和血流中发挥重要作用。本研究发现浸水束缚应激能诱导回肠和支配回肠组织相应阶段DRG中TRPA1表达上调（图2～5），回肠黏膜损伤。这可能是因为TRPA1被激活时可促使Ca2+通过TRPA1内流，引起下游通路P物质释放，而P物质具有激活肥大细胞的生物学活性［5］。肥大细胞广泛分布于内脏黏膜下的微血管周围，被激活时可释放组胺、5-HT、P物质、血小板活化因子、白三烯等物质；同时，TRPA1被激活时，可以改变上皮细胞的功能，促进肠嗜铬细胞释放大量5-HT，导致平滑肌细胞超极化，引起浓度依赖式的张力性血管舒张［6］，这些均可引起血管通透性增强及血管蛋白渗漏和中性粒细胞浸润并参与炎症反应［7-8］，导致回肠水肿、糜烂、溃疡甚至出血。同时，P物质也能改变免疫功能，促进炎症因子的释放，引起肠黏膜损伤［9］。同时，笔者前期实验研究发现TRPA1在支配胃肠道的背根神经节和感觉神经纤维中有功能表达［10-11］，所以，TRPA1能够调节胃肠道炎症和外源性传入和传出感觉神经纤维的作用［12］。TRPA1表达在肠上皮细胞、肠嗜铬细胞、肥大细胞和一系列伤害性感觉神经元，其中很多细胞具有感觉特性，能与临近的伤害性感受器（nociceptor）进行交流，介导炎症反应，而炎症反应在肠损伤中发挥重要作［13-14］。MEENTS等［13］报道TRPA1在伤害性感觉神经元中表达，可被内源性炎症介质和氧化应激代谢物激活。这些因素共同作用引起肠黏膜损伤。

本研究发现浸水束缚应激前给大鼠腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031，抑制TRPA1的表达，从而抑制了后续发生的一系列伤害性反应，可以明显改善应激性肠黏膜的损伤情况。NAKAMURA等［15］研究证明，预先给于HC-030031可以明显改善小鼠足底注射TRPA1的激动剂异硫氰酸烯丙酯引起的P物质释放、伤害性行为、热痛觉过敏、水肿和炎症反应，这和笔者的研究结论相似。

总之，应激引起的急性肠黏膜损伤被认为是机体神经内分泌失调、局部肠黏膜缺血缺氧、肠黏膜严重的微循环障碍、细胞凋亡、炎症细胞浸润及各种促炎症因子的产生等多因素共同作用，最终导致肠黏膜损伤因素增强、保护屏障破坏，维持肠黏膜完整性的平衡因子失调的后果。但是TRPA1具体通过哪些通路影响胃肠道功能，需要笔者进一步研究和探索。