茵陈蒿汤对非酒精性脂肪肝伴糖尿病大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

周伟青 刘道利 王修银 江桂英 李秋明 林佳

广州市中医医院1检验科，2病理科，3药学部（广州510130）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝细胞内脂肪过度沉积导致的疾病，同时排除酒精因素和其他肝损害因素。NAFLD根据病情严重程度，可分为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化等。近年来，随着人民群众生活水平的提高，肥胖人群比例逐年上升，NAFLD的发病率也显著升高［1］。对于NAFLD的治疗，主要以调整饮食结构、降血脂、胰岛素增敏剂、改善肝功能等为主。近年来的研究发现，NAFLD患者多合并有胰岛素抵抗，甚至糖尿病（diabetes mellitus，DM）。既往的研究指出，茵陈蒿汤能够通过调节p38MAPK控制NAFLD的疾病进展，但其对NAFLD合并DM的疗效研究较少［2］。本次研究通过建立NAFLD合并DM的大鼠模型，研究p38MAPK在大鼠肝脏中的表达，并探讨茵陈蒿汤对其的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物150～180 g，SPF级，5～7周龄SD大鼠，雌雄各半［购自广东省医学实验动物中心，生产许可证SCXK（粤）2013-0002］；在温度25℃、相对湿度50%的独立通气笼里进行无菌饲养，且符合清洁级实验动物的饲养标准。小鼠均进行编号，编号标签贴于饲养笼处，并按随机数字表法将实验小鼠分为3组：对照组（12只）、DM组（15只）、DM+药物组（12只）。

对照组大鼠予以低脂饲养56 d，而DM组和DM+药物组大鼠均以高脂（胆固醇2%，猪油10%加入基础饲料中）饲养28 d后，予以空腹一次性腹腔注射链脲佐菌素（30 mg/kg），3 d后所有动物禁食12 h，麻醉后经大鼠眼眶后静脉丛取血后，大鼠立即进行止血、消炎和保温，清醒后仔细观察其动态，无异常情况，继续饲养。血液标本立即低温保存，送检，用日立全自动生化分析仪7180检测空腹血糖，经反复3次实验测定结果均空腹血糖＞7.8 mmol/L，成功建立DM大鼠模型。继续予以高脂饲养8周，随机抽取3只DM组大鼠进行形态学观察，均符合NAFLD病理学改变则制作DM伴发NAFLD模型成功。

1.2方法

1.2.1动物模型和用药高脂饲养8周后，12只DM+药物组大鼠继续予以1 mL/100 g鼠重的茵陈蒿汤［3］（厦门中药厂）；而12只对照组和剩下12只DM组则予以相应量的饮用水灌服；连续灌服28 d。

1.2.2生化指标测定禁食半天后采用ES-500E电子天平进行体质量测量并记录，单位为g。实验大鼠麻醉后处死，在实验小鼠腹主动脉取血2 mL，高速离心，4℃，3 000 r/min离心15 min，用日立全自动生化分析仪7180检测空腹血糖、血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和总胆固醇（total cholesterol，TC）。

1.2.3肝脏病理检查完整取出实验大鼠的肝组织，采用ES-500E电子天平对肝组织称重并记录，单位为g，计算肝体比（肝体比=肝重/体质量）。称取1 g肝组织，梯度脱水，冰冻切片胶包埋，采用冰冻切片机进行冰冻切片（片厚4.0 μm），HE染色，荧光倒置显微镜下观察，拍照。

1.2.4Western blot检测p38MAPK蛋白表达水平取1 g肝组织块置于预冷的单去污裂解液（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆，裂解30 min后，将裂解液移至1.5 mL离心管中，4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液按BSA法测定总蛋白浓度，计算含40 μg蛋白的上层缓冲液，经12%SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，室温平摇2 h，取出PVDF膜，用TBS/T漂洗3次，每次5 min，置于干净平皿中，分别加入兔抗大鼠p38MAPK抗体（1∶1 000）、GAPDH抗体（1∶1 000），4℃过夜，取出PVDF膜，TBS/T漂洗3次，每次5 min，再分别加入山羊抗兔IgG（1∶3 000），室温孵育1 h，取出PVDF膜，用TBS/T漂洗3次，每次5 min，除去未结合的二抗进行显色反应，分析条带的吸光度。

1.3统计学方法采用SPSS 11.5统计软件对数据进行分析，符合正态分布的计量资料用s表示，多组间采用单因素ANOVA进行检验，若方差齐性，两两组间采用LSD检验进行比较，若方差不齐，则用Tamhane′s T2检验进行比较；若P＜ 0.05，则差异具有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况比较DM组大鼠的体质量显著高于对照组（P＜0.05），而DM+药物组大鼠的体质量则显著降低（P＜0.05）。DM组大鼠的肝重及肝体比均显著高于对照组（P＜0.05），而DM+药物组大鼠的肝重及肝体比均显著降低（P＜0.05）。DM+药物组大鼠的空腹血糖水平亦较DM组明显降低（P＜0.05）。见表1。

2.2肝脏病理检查结果分析对照组大鼠肝脏细胞排列整齐，大小正常，无明显炎性变化或脂肪（图1）。DM组大鼠肝脏细胞排列紊乱，体积增大伴炎性浸润，汇管区胞浆内可见脂肪空泡，肝组织内可见明显点灶状坏死（图2）。DM+药物组大鼠肝脏细胞存在脂肪样变，坏死病灶缩小，脂肪空泡和炎性细胞浸润减少（图3）。

表1 3组大鼠体质量、肝重及血糖情况比较Tab.1 comparison of body weight，liver weight，and blood glucose of mice in 3 groups 例（%）

2.3生化指标比较DM组大鼠的ALT、AST和TC水平均较对照组显著升高（P＜0.05）；而与DM组相比，DM+药物组大鼠ALT、AST和TC水平均显著降低（P＜0.05）。见表2。

2.4肝脏组织p38MAPK的表达比较Western blot检测结果显示，DM组大鼠肝脏p38MAPK表达水平显著低于对照组（P＜0.05），而DM+药物组的p38MAPK表达水平显著高于DM组（P＜0.05），见表3和图4。

图1 对照组大鼠肝脏病理检查结果分析（HE染色，200×） 图2 DM组大鼠肝脏病理检查结果分析（HE染色，200×）图3 DM+药物组大鼠肝脏病理检查结果分析（HE染色，200×）Fig.1 Pathological examination of the mice liver in blank group（HE Staining，200×） Fig.2 Pathological examination of the mice liver in DM group（HE Staining，200 ×） Fig.3 Pathological examination of the mice liver in DM+Drug group（HE Staining，200×）

表2 3组大鼠生化指标比较Tab.2 Comparison of biochemical biomarkers of mice in 3 groups ± s

表2 3组大鼠生化指标比较Tab.2 Comparison of biochemical biomarkers of mice in 3 groups ± s

注：与对照组相比，aP＜0.05；与DM组相比，bP＜0.05

组别对照组DM组DM+药物组ALT（U/L）30.07±1.90 78.73±6.98a 46.63±4.01b AST（U/L）33.31±2.26 52.57±6.30a 38.18±3.61b TC（mmol/L）5.32±0.37 7.32±0.64a 6.33±0.39b

表3 3组大鼠肝脏组织p38MAPK表达情况比较Tab.3 Comparison of p38MAPK expression of the mice liver in 3 groups± s

表3 3组大鼠肝脏组织p38MAPK表达情况比较Tab.3 Comparison of p38MAPK expression of the mice liver in 3 groups± s

注：与对照组相比，aP＜0.05；与DM组相比，bP＜0.05

组别对照组DM组DM+药物组肝脏组织p38MAPK表达2.86±0.57 0.52±0.07a 1.47±0.36b

3 讨论

图4 3组大鼠肝脏组织p38MAPK表达的结果（Western blot检测）Fig.4 p38MAPK expression of the mice liver in 3 groups（Western blot）

近年来，随着生活水平的提高，社会饮食习惯的改变，肥胖人群逐渐增多，NAFLD的发病率也逐年升高［4］。NAFLD与患者的体脂率有关，高血压、高血糖和高血脂都是该病的危险因素［5］。此外，近年研究显示NAFLD的发病与胰岛素抵抗存在很大的关系，p38MAPK信号通路是哺乳动物细胞中介导细胞反应的重要信号通路之一，其与细胞增殖、生长、分化、凋亡、炎症反应等都有很大关系［6-7］。研究［8］表明，p38MAPK是肝脏中葡萄糖代谢和脂肪代谢中极为重要的环节，其能够促进葡萄糖的合并，减少脂肪合成。而在2型糖尿病的研究中发现，p38MAPK信号通路存在异常，而p38MAPK活性与患者的胰岛素抵抗程度存在相关性［9-10］。既往的研究［11-13］指出，在大鼠NAFLD中的p38MAPK磷酸化明显增加，而小檗碱、祛痰活血颗粒等药物都能够有效调节NAFLD模型大鼠的p38MAPK信号通路。茵陈蒿汤记载于《伤寒论》，由茵陈、栀子和大黄构成。研究［14］表明，茵陈蒿汤可以促进胆红素的排泄、保护肝脏细胞膜的完整性、防止氧自由基的生成等功能。既往的研究指出，茵陈蒿汤能够降低NAFLD患者的血脂情况，在大鼠模型中亦得到了验证。但茵陈蒿汤对NAFLD合并DM疗效的相关研究较少。

本实验通过建立DM大鼠模型，并予以茵陈蒿汤治疗DM诱导的NAFLD，探讨茵陈蒿汤对NAFLD合并DM的疗效。本研究发现，DM诱导的NAFLD大鼠肝脏中的p38MAPK表达降低，提示p38MAPK通路受到抑制，而茵陈蒿汤能够提高DM诱导的NAFLD大鼠肝脏p38MAPK表达，提示茵陈蒿汤通过p38MAPK通路减轻NAFLD大鼠肝脏的损伤；而DM大鼠的空腹血糖水平亦有所缓解。本研究为了临床上应用茵陈蒿汤治疗NAFLD合并DM患者提供了有力的依据，亦为深入探讨NAFLD合并DM的疾病发展提供了参考。

既往的研究［15-20］提示，p38MAPK与炎症反应亦有密切的关系，而NAFLD患者长期处于慢性全身炎症状态，炎症因子水平较健康人群有明显升高。因此，在之后的研究中，笔者将着重于进一步探讨茵陈蒿汤通过p38MAPK通路调控通路下游的炎症因子的机制。

综上所述，本研究证实了茵陈蒿汤通过调控p38MAPK，减轻NAFLD合并DM大鼠的肝脏损害和糖代谢异常。笔者将进一步探讨其相关机制，让茵陈蒿汤能够用于治疗NAFLD合并DM。