2型糖尿病和糖尿病肾病患者血清miR-181b水平及意义

王琳琳 冯佳莉 刘俊芬 郝秀轻 左路广 刘圣君 刘华

河北北方学院附属第一医院1肾内科，2病理科，3检验科（河北张家口075000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）常见的并发症之一，发病较为隐匿，加之目前诊断手段存在一定局限性，较难早期诊断DN并进行有效治疗［1-3］。有研究［4-5］报道，约有30%～35%的T2DM患者并发DN，最终发展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）。ESRD患者需长期接受维持行肾脏替代治疗，5年生存率极低，约为20%［6］。目前，肾脏活检是确诊DN的金标准，但由于其具有创伤性及不便利性，多数患者较难接受，因此，较难用于临床筛查及推广。尿白蛋白/肌酐比值（urinary albuminuria/creatinine ratio，ACR）对于DN诊断有一定价值，但易受其他因素影响，如控制血糖及肾脏相关指标可抑制ACR升高。因此，探寻用于DN诊断的敏感度和特异度均较高的生物标志物势在必行。微RNA（microRNA，miR）是一类非编码蛋白质的小分子RNA，广泛参与机体的生理、病理过程的调控［7］。近年来，有研究［8］证实miR-181b可以靶向调控TIMP3参与DN的病理生理过程。但关于miR-181b在DN患者中的表达及其与DN发病及预后的关系还未阐明。因此，笔者选择T2DM和DN患者作为研究对象，探究miR-181b在其发病及预后中的作用，以期为DN的诊断及治疗提供帮助。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料前瞻性选取2016年5月至2017年4月在本院就诊的87例T2DM并发DN患者（DN组）作为研究对象。另择同期84例单纯T2DM患者（T2DM组）和90例健康体检者（对照组）作为对照。根据世界卫生组织（WHO）制定的T2DM诊断标准及美国糖尿病协会制定的DN诊断标准对T2DM并发DN患者进行诊断。纳入标准：（1）肾脏病理活检或相关临床指征符合DN特点；（2）签署了知情同意书。排除标准：（1）合并心脑血管疾病；（2）并发酮症酸中毒；（3）合并甲状腺疾病或其他代谢性疾病；（4）急、慢性肾小球肾炎、尿路感染或其他肾脏相关疾病；（5）使用过免疫抑制剂或其他肾脏毒性药物；（6）妊娠或哺乳期妇女。DN组男49例，女48例，平均年龄（46.56±8.72）岁；T2DM组男45例，女39例，平均年龄（47.38±9.37）岁；对照组男48例，女42例，平均年龄（46.45±8.72）岁。3组受试者基线资料见表1。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1资料收集收集受试者年龄、性别、身高、体质量、收缩压、舒张压、病程、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HAblc）、肌酐（SCr）及尿微量白蛋白水平等。并计算体质量指数（BMI）、估算的肾小球滤过率（eGFR）和尿微量白蛋白与肌酐比值（ACR）。BMI=体质量（kg）/身高2（m2）；eGFR=a×（Scr／b）c×（0.993）年龄［男性：a=141，b=0.9，c=-0.411（Scr≤ 0.7 mg/dL）或-1.209（Scr＞0.7 mg/dL）；女性：a=144，b=0.7，c=-0.329（Scr≤ 0.7 mg/dL）或-1.209（Scr＞0.7 mg/dL）］；ACR=尿白蛋白（mg/L）/Cr（g/L）。

1.2.2血清miR-181b水平检测采用RT-qPCR法检测受试者血清miR-181b水平。抽取受试者肘部静脉血10 mL，3 500 r/min离心15 min后，提取上层清液于EP管中。将上清液加至TRIzol®LS试剂盒［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］中提取总RNA，并用紫外分光光度计（上海美谱达公司）检测总RNA浓度及纯度。取2 μg总RNA加至反转录试剂盒［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］中，进行反转录反应。取反转录产物进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环40 次。miR-181b序列 F：GCGGATCATTCATTGCTGTCG，R：GTGCAGGGTCCGAGGT；U6序列F：CTCGCTTCGGCAGCACATA，R：GTGCAGGGTCCGAGGT。U6为内参，采用 2-ΔΔCt表示受试者血清 miR-181b 水平。

1.2.3预后随访对87例T2DM并发DN患者进行为期2年的随访，主要通过复诊及电话随访等方式，每月随访1次，了解患者是否进展为ESRD，随访至2019年4月。ESRD定义为接受维持行血液透析治疗或eGFR＜15 mL/（min·1.73 m2）［9］。

1.3统计学方法采用SPSS 23.0软件进行统计分析。服从正态分布的计量资料用均数±标准差表示，3组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法；不服从正态分布的计量资料用中位数和四分位数间距［M（Q1，Q3）］表示，3组间比较采用Kruskal Wallis检验，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。采用Pearson和Spearman相关分析血清miR-181b水平与临床及病理指标的关系，并用多元线性回归分析于miR-181b独立相关的因素。用受试者工作特征（ROC）曲线评价血清miR-181b诊断T2DM进展为DN的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.13组受试者基线资料比较3组受试者在年龄、性别、BMI及舒张压水平方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在病程、收缩压、FPG、HAblc、eGFR及ACR水平方面比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.23组受试者血清miR-181b水平比较3组受试者血清miR-181b水平比较，差异有统计学意义（F=324.775，P＜0.001）。DN组血清miR-181b水平为（2.56±0.62），高于T2DM组（1.55±0.41）和对照组（0.88±0.19），差异均有统计学意义（P＜0.05）。T2DM组血清miR-181b水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3血清miR-181b水平与临床及病理指标的关系3组受试者血清miR-181b水平与收缩压和ACR 均呈正相关关系（r=0.238，P=0.001；rs=0.577，P＜0.001）。将血清miR-181b水平作为因变量，将收缩压和ACR作为自变量纳入多元线性回归分析，结果显示收缩压和ACR均与miR-181b独立相关。见表2。

2.4血清miR-181b诊断T2DM进展为DN的效能ACR诊断T2DM进展为DN的ROC曲线下面积（AUC）为 0.995（95%CI：0.970～1.000），最大约登指数为0.943，其所对应的Cut-off值、敏感度和特异度分别为36.01、94.25%和100.00%。血清miR-181b诊断T2DM进展为DN的AUC为0.911（95%CI：0.858～0.949），最大约登指数为0.689，其所对应的Cut-off值、敏感度和特异度分别为2.30、71.26%和97.62%。血清miR-181b诊断T2DM进展为DN的AUC低于ACR诊断T2DM进展为DN的AUC，差异有统计学意义（Z=3.932，P＜0.001）。见图1。

表1 3组基线资料比较Tab.1 Comparison of three sets of baseline data 例，± s

表1 3组基线资料比较Tab.1 Comparison of three sets of baseline data 例，± s

注：与对照组比较，*P＜0.05；与T2DM组比较，#P＜0.05

分组DN组T2DM组对照组F/χ2/Z值P值例数87 84 90年龄（岁）46.56±8.72 47.38±9.37 46.45±8.72 0.283 0.758性别（男/女）49/38 45/39 48/42 0.194 0.908病程（年）9.92（5.58，12.17）#7.50（3.50，9.83）—3.603 0.042 BMI（kg/m2）25.68±5.13 25.37±4.80 24.28±4.46 2.081 0.127收缩压（mmHg）142.64±9.78*#127.70±8.74*110.24±5.37 350.673＜0.001分组DN组T2DM组对照组F/χ2/Z值P值例数87 84 90舒张压［M（Q1，Q3）］84（81，86）84（79，87）77（73，84）0.878 0.285 FPG（mmol/L）7.34±2.60*#9.11±2.51*5.05±0.52 82.604＜0.001 HAblc（%）7.3±1.8*#8.9±2.4*5.0±0.5 111.113＜0.001 eGFR［mL/（min·1.73m2）］71.2±15.3*#108.6±11.2*116.9±10.4 333.392＜0.001 ACR［M（Q1，Q3），×10-3］148.26（75.03，850.28）*#14.25（9.07，19.25）14.09（9.05，18.16）170.502＜0.001

表2 miR-181b的多元线性回归分析结果Tab.2 Results of multiple Linear regression Analysis of miR-181b

图1 血清miR-181b诊断T2DM进展为DN的效能Fig.1 The diagnostic efficacy of serum microRNA-181b in the progression of T2DM to DN

2.5血清miR-181b水平与DN预后的关系取DN组患者血清miR-181b水平的中位数（2.55）为界，将其分为miR-181b高水平组（n=43）和miR-181b低水平组（n=44）。DN组患者共有36例（41.38%）进展为ESRD。其中，miR-181b高水平组患者共有28例（65.12%）进展为ESRD，miR-181b低水平组患者共有8例（18.18%）进展为ESRD，差异有统计学意义（χ2=19.749，P＜0.001）。

3 讨论

近年来，全球T2DM发病率逐年攀升，严重影响人们的生命健康［10］。DN作为T2DM常见的并发症之一，伴随T2DM发病率的升高，其发病率也逐年升高［11］。DN发病较为隐匿，且发病机制较为复杂，很难在疾病早期诊断，因此，多数患者在发现时已进展为DN临床期，最终进展为ESRD［12］。目前，对于DN的治疗主要手段为控制糖、脂代谢，纠正血压等，并不能从根本上抑制DN的疾病进展［13］。因此，探寻早期诊断DN及预后评估的生物标志物意义重大。miR-181b是miR-181家族中的一员。有研究［14-16］显示，miR-181b在慢性淋巴细胞白血病、胃癌及肺癌中特异性表达，并参与上述肿瘤的发病及疾病进展过程。但关于miR-181b在DN中的表达及其与预后的关系还未可知。

本研究比较了对照组、T2DM组及DN组患者血清miR-181b水平，发现DN组血清miR-181b水平高于T2DM组和对照组，T2DM组血清miR-181b水平高于对照组，提示miR-181b可能参与了T2DM的发生、发展过程，并促使T2DM进展为DN。相关性分析结果显示血清miR-181b水平与收缩压和ACR均呈正相关关系，结合上述研究结果，提示血清miR-181b可能成为DN诊断的生物标志物，并有助于DN治疗疗效及预后的判断。为证实上述猜想，笔者构建了血清miR-181b诊断T2DM进展为DN的ROC曲线，结果显示其ROC AUC为0.911，虽诊断效能低于ACR诊断T2DM进展为DN的ROC AUC，但诊断效能仍较高，可辅助T2DM进展为DN的诊断。本研究对87例DN患者进行了2年的跟踪随访，了解到36例DN患者进展为ESRD，该结果与韩辉等［9］随访结果接近。笔者进一步比较了miR-181b高水平组和低水平组患者进展为ESRD的发病率，结果显示miR-181b高水平组患者进展为ESRD的发病率高于miR-181b低水平组，提示miR-181b与DN患者预后有关，有望成为判断DN进展的生物标志物。

本研究结果显示血清miR-181b水平与收缩压和ACR独立相关。因此，笔者推测miR-181b可能间接或直接靶向调控收缩压和ACR，进一步加重DN病情进展，但有关其病理、生理机制仍有待开展实验证实。本研究简要探究了DN的发病机制，为其发病机制研究提供了方向，同时也为其治疗提供了靶点，但仍有一定不足，下一步将扩大样本量，进行多中心研究，同时动态观察血清miR-181b水平变化，进一步补充本研究结论。同时，开展基础研究，进一步探究miR-181b参与T2DM进展为DN及DN进展的分子机制，以弥补本研究的不足。

综上所述，T2DM和DN患者血清miR-181b水平升高。miR-181b与收缩压和ACR独立相关。检测血清miR-181b水平有助于DN诊断及预后评估。与DN诊断的金标准肾脏病理活检相比，检测血清miR-181b水平更为便捷，且无创，患者更能接受。