甲氧虫酰肼对蚕体谷草转氨酶和谷丙转氨酶的影响

2019-10-11吕艳艳吴朋飞严会超王叶元

广东蚕业 2019年6期

吕艳艳吴朋飞王飞严会超徐成王叶元※

（1.华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系广东广州 510642；2.华南农业大学艺术学院广东广州 510642）

1 前言

家蚕是一种以桑叶为主饲料且能吐丝结茧的经济昆虫，在农业生态系统中，家蚕与其它昆虫相比对农药更为敏感，蚕体直接接触或食下被农药严重污染的桑叶时都会引起家蚕急性中毒或慢性中毒，因此它是一种我国农药登记中环境生态的非靶标生物，也是广泛用于科学研究的模式昆虫之一[1]。

蚕品种、农药类别和发育阶段等多种因素都会影响到农药对家蚕的毒性。一般情况下，除蚁蚕外，二龄蚕对农药最为敏感，对其他龄期来说，龄期越大越不敏感。但是五龄期比较特殊，五龄中后期蚕会对农药比低龄期更为敏感，即使添食微量的农药也会导致家蚕结畸形茧或不结茧，使羽化后的雌蛾产卵量降低或不产卵。除此之外，也不是所有的农药对家蚕都表现为急性致死效应，因此在评价作用机制比较特殊的杀虫剂（例如甲氧虫酰肼）对家蚕的毒性时，还应对它的生长发育及生理变化等情况做进一步观察和研究[1～2]。

1.1 甲氧虫酰肼简介

农药种类繁多，依据用途不同可将其分为：杀虫剂、植物生长调节剂、杀菌剂、杀软体动物剂、杀鼠剂、杀线虫剂、除草剂等七个大类。

甲氧虫酰肼是一种新型的杀虫剂类型的农药，主要适用于杀害鳞翅目害虫，在昆虫发生自然蜕皮之前的任何时间它都可以对昆虫产生抑制蜕皮作用[3]。其原理是它的结构与鳞翅目昆虫分泌的蜕皮激素相似，会导致鳞翅目类昆虫提前发生蜕皮反应，但是由于体内的某些物质不足而不能形成新表皮，最后昆虫会脱水或者饥饿而最终死亡。甲氧虫酰肼以触杀作用为主，也有少量的内吸作用。目前甲氧虫酰肼已经被广泛应用于蔬菜、小麦、果树、棉花等农作物的田间鳞翅目害虫（如甜菜夜蛾）的防治。因此，它成为桑园相邻的农田害虫防治中比较常用的农药之一。

国内外对甲氧虫酰肼的研究较多，主要是研究甲氧虫酰肼对鳞翅目类害虫的毒性。研究表明甲氧虫酰肼对棉铃虫、玉米螟、甘薯麦蛾、甜菜夜蛾、蓟马、斜纹夜蛾、大螟、美国白蛾、杨小舟蛾、茶尺蠖、黄夜螟、菜青虫等多种鳞翅目害虫都有毒害作用，其中有些是关于甲氧虫酰肼对上述某种鳞翅目害虫的毒性、安全性评估、生理生化影响的研究[4～5]。

但关于甲氧虫酰肼对家蚕的研究文献较少，有关于甲氧虫酰肼对家蚕的发育、变态和主要蛋白合成的影响[6]，及阿维菌素和甲氧虫酰肼两种农药分别对家蚕的毒性及混合后对家蚕的毒性，并根据毒性测定结果进行了安全评估[7]。

1.2 谷草转氨酶和谷丙转氨酶概况

谷丙转氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，简写GPT）与蚕体内的蛋白质代谢有关。

丙氨酸是蚕丝的主要合成原料，故丙氨酸的生成量能够在很大程度上影响蚕丝的生成量。而丙氨酸的合成有两条主要途径：I. 桑叶里的大量天门冬氨酸可以通过谷丙转氨酶的作用及草酰乙酸的脱酸作用生成丙氨酸；II. 在辅酶Ⅰ的递氢作用下，乳酸脱氢酶与谷氨酸发生偶联反应，并在谷丙转氨酶的作用下生成丙氨酸。在这两条途径中，谷丙转氨酶都发挥了重要的作用，因此谷丙转氨酶可以作为预测蚕桑经济性状的重要指标之一。

谷草转氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，简写GOT）也是蚕体内一种比较重要的酶，它大量存在于家蚕后部丝腺，跟谷丙转氨酶的作用一样，可以把谷氨酸转化为丝素蛋白的主要氨基酸之一——甘氨酸。谷草转氨酶也可以作为桑蚕经济性状的重要生化指标。

一些研究结果表明家蚕后部丝腺的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性与家蚕的茧质相关，五龄第三天呈显著正相关，第五天则相关不显著，第七天却变为极显著负相关。因此这两种酶可作为预测家蚕产丝量的重要生化指标[9]。

关于蚕体不同部位谷丙转氨酶含量的研究，刘限[10]测定了春柞蚕不同品种的中部、后部丝腺的谷丙转氨酶活性，研究结果表明谷丙转氨酶的含量是影响蚕丝质量的重要指标。关于蚕体内谷草转氨酶的研究则特别少，关于谷草转氨酶的研究大部分都是关于人体肝脏的。研究农药对动物的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量的影响[11～13]，主要研究对象有鱼类、哺乳动物类等。张彬彬[11]研究了农药乙草胺对泥鳅肝脏内的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性的影响，主要通过不同浓度的乙草胺溶液浸泡泥鳅不同的时间后，测定泥鳅肝脏内的谷丙转氨酶和谷草转氨酶来研究该农药对泥鳅生理生化的影响，该实验结果表明：用乙草胺处理泥鳅一定时间可诱导其组织内的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性提高，除此之外乙草胺浓度和暴露时间与泥鳅的谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性变化存在一定的剂量、时间效应关系。

1.3 研究意义及目的

家蚕是一种鳞翅目昆虫，它是以桑叶为主饲料的寡食性昆虫，其生长发育容易受到环境、饲料、病原微生物等因素影响，特别是桑园种植规模零星、分散，或与其它农作物混种，由于农药使用不规范，环境污染越来越严重，养蚕安全逐渐受到关注。本文研究添食不同浓度的甲氧虫酰肼对家蚕体内的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响，为家蚕的风险评估和制定家蚕安全健康养殖措施提供数据参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 药品和试剂

谷草转氨酶试剂盒（南京建成生物研究所），谷丙转氨酶试剂盒（南京建成生物研究所），无水乙醇，85 %磷酸溶液，生理盐水，考马斯亮蓝 G-250 ，标准蛋白溶液，99.1 %甲氧虫酰肼原药（由上海市农药研究所有限公司生产，北京北纳创联生物技术研究所供应）。

2.1.2 仪器设备

玻璃十字柄匀浆器，离心机，天平，制冰机，冰箱，离心管，移液枪，量筒，烧杯，水浴锅，紫外分光光度仪，容量瓶，锥形瓶，试管，比色皿，试管架，烘箱，玻璃棒。

2.1.3 实验动物

9·芙蚕品种，由广东省蚕业技术推广中心提供。

2.2 方法

2.2.1 甲氧虫酰肼添食方法

将桑叶完全浸泡在不同浓度的甲氧虫酰肼溶液 10 s后，晾干，给家蚕添食。

2.2.1.1 二、三龄蚕添食方法

根据预试验结果，96 h LC50为 0.144 mg a.i./L及GB/T31270.11 -2014 化学农药环境安全评价试验准则第 11部分：家蚕急性毒性试验、中华人民共和国农业行业标准——化学农药家蚕慢性毒性试验准则（征求意见稿）。将二、三龄蚕分为9个组，一个空白对照组，一个溶剂对照组和 7个不同浓度的甲氧虫酰肼添食组，组距为 1.5，每组 3个平行，每个平行 25 头蚕，同时在相同条件下养第四个平行30 头蚕以备用。每组的编号及添食操作情况如表1。

其中受试物浓度的配置方法是：①称取 0.01261 g受试物，用 0.4 mL N,N-二甲基甲酰胺和 0.025 g吐温 80 溶解后，加入适量去离子水，转移进50 mL容量瓶中，定容得到浓度为250 mg a.i./L的受试物溶液。②将该浓度的受试物浓度用去离子水稀释到所需浓度。③溶剂对照组配制方法主要为先量取0.4mL N,N-二甲基甲酰胺和0.025 g吐温80 加入50 mL容量瓶中，用去离子水定容至标线，得到溶剂对照组贮备液1。从中取0.5 mL于50 mL容量瓶中，用去离子水定容至标线，得到溶剂对照组贮备液 2。④从溶剂对照组贮备液2中量取6.40 mL于200 mL容量瓶，配制成溶剂对照组溶液。

表1 浸叶法—试验分组及浓度设计

空白组的桑叶不用浸泡。试验组和溶剂对照组在二龄起至三龄末期间添食不同浓度处理的桑叶，四至五龄添食正常桑叶。五龄第八天取样蚕，-80 ℃的冰箱中保存以备使用。

2.2.1.2 五龄蚕添食方法

五龄家蚕采用同样的分组方法，组距为1.8，受试物的配置方法与 2.2.1.1相同，但是受试物浓度分别为 1.63 ×10-4mg.a.i./L，2.94 ×10-4mg.a.i./L，5.29 ×10-4mg.a.i./L，9.53×10-4mg.a.i./L，1.71 ×10-3mg.a.i./L，3.09 ×10-3mg.a.i./L，5.56 ×10-3mg.a.i./L。从五龄起开始喂食，在五龄第八天取样。

2.2.2 组织液获取方法

在五龄第八天，每组的每个平行中随机取1头蚕，每组共3头蚕，在-80 ℃存储。实验前取出蚕称重，再与其体重9倍的生理盐水混合后用玻璃十字柄匀浆器在冰水环境下研磨混匀后倒入离心管离心，2500 r/min离心10 min后，取上清液2 mL保存于离心管中做标记，并将这些标记好的上清液存于-40 ℃的冰箱中保存以待测量。剩余的上清液取出放入一个离心管内标记好保存在-40 ℃冰箱中另放好以备用。

2.2.3 测定蛋白质浓度的方法

主要采用考马斯亮蓝G-250 法测定[14]。

2.2.4 谷丙转氨酶的测定

按试剂盒要求操作。

2.2.5 谷草转氨酶的测定

按试剂盒要求操作。

2.2.6 数据分析处理

本次数据分析使用的软件主要是 Microsoft Office家庭版和学生版2016 的Exce1和SPSS.24.0。Excel用来计算蛋白质浓度及谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量。SPSS软件主要通过单因素方差分析比较来对添食不同浓度甲氧虫酰肼的最终酶含量与对照组进行显著性差异分析（P＜0.05）。如果差异性达到显著关系再用Duncan’s多重比较分析。数据分析的结果均以“平均数±标准误差a，b…”呈现。写字母代表Duncan’s多重分析结果。

3 结果

3.1 蛋白质测定结果

3.1.1 标准曲线的测定

蛋白质测定标准曲线的结果如表 2。制作标准曲线如图1，得到的回归方程为y=0.0006 x-0.0213 ，用该公式计算蛋白质浓度，见表3。

表2 蛋白质测定标准曲线数据

图1 测定蛋白质的标准曲线

3.1.2 蛋白质浓度结果

表3 蛋白质浓度结果

3.2 酶含量的测定结果

3.2.1 二三龄期添食酶含量

表4 二、三龄添食酶含量测定结果

从表 4可以看出，二、三龄蚕谷草转氨酶活性，除了T3和 T7两组之外，其它试验组与对照组间都有显著性增加。谷丙转氨酶活性，除了 T3和 T7两组，其它试验组与对照组之间有显著性增加。

3.2.2 五龄期添食酶含量

表5 五龄添食酶含量测定结果

五龄添食酶含量测定结果见表 5，谷草转氨酶活性除了T4、T6和T7试验组的结果显著低于空白对照组外，其他试验组与空白对照组都没有显著差异，且所有试验组都与溶剂对照组没有显著差异。谷丙转氨酶活性，试验组 T2、T3、T5、T6与空白对照组之间有显著增加；而与溶剂对照组相比，则只有T3和T5两组有显著差异。

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 不同龄期对农药敏感性不一样

根据实验结果可以看出，二、三龄蚕添食甲氧虫酰肼，除了浓度为 2.27 ×10-3mg.a.i./L，1.40 ×10-2mg.a.i./L，其他添食浓度谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量有显著增加。而五龄添食甲氧虫酰肼，则大部分浓度都不会导致两种酶的含量显著增加，该结果与来有鹏[1]认为家蚕不同龄期对农药的敏感程度是不一样的结论相符。

4.1.2 家蚕生理变化与茧质调查结果

课题组后续调查了添食上述不同浓度的甲氧虫酰肼对家蚕茧质的影响，结果表明二、三龄添食的蚕，试验组全茧量、茧层量、茧层率和蛹重都相对对照组随浓度的增加而降低，但经生物统计分析它们之间均无显著差异。结合本实验的结果推测可能是二、三龄添食甲氧虫酰肼后，导致蚕体内蛋白代谢紊乱，故蚕体组织内谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性总体上有所增加，此时蚕体吸收的营养物质主要用于生长发育，并不是用于合成丝物质和造卵，故对蚕体后部丝腺的谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量并没有显著的变化，因此对茧质影响不大。

五龄蚕添食，试验组全茧量、茧层量、茧层率和蛹重都相对对照组有显著降低，并呈现出随浓度的增加而降低的规律。五龄一直添食甲氧虫酰肼，导致蚕体组织蛋白代谢紊乱，五龄期蚕消化吸收的营养主要用于丝物质合成，我们测定的是第八天的谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量，有些浓度有差异、有些没差异，可能我们测的是蚕体，而不能完全反应丝腺组织的谷草转氨酶和谷丙转氨酶，彭卫平[9]研究结果认为家蚕后部丝腺的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性与家蚕的茧质相关，五龄第三天呈显著正相关，第五天则相关不显著，第七天为却变为极显著负相关。可能不同浓度的酶活性与家蚕茧质也存在正相关或负相关。

4.1.3 建议

本实验只研究了不同龄期和不同浓度的甲氧虫酰肼对蚕的影响。甲氧虫酰肼对蚕的毒性影响不仅受到龄期，药物浓度等因素的影响，它还可能受到蚕品种，添食方法等多种因素影响。本次实验结果表明即使是微量的甲氧虫酰肼也会对家蚕的生理造成一定的影响，并会对茧质造成影响。因此，建议桑园一定要建立在远离可能会使用甲氧虫酰肼等农药的农田，除此之外，也要十分注意桑园用水是否会受到甲氧虫酰肼污染。