酸性氧化铝前处理甜叶菊叶片甜菊糖苷分析样品的质谱验证

罗庆云，印敏，陈玉江，缪慧敏，陈婉婷，谭曦曦

（1.南京农业大学园艺学院，南京210095；2.江苏省中国科学院植物研究所/南京中山植物园/江苏省药用植物研究开发中心，南京2100141；3.南京农业大学食品科技学院，南京210095）

0 引言

甜菊糖苷是甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)、甜茶（Rubus suavissimus S.Lee）等植物叶片中以四环二萜为母核合成的一类糖苷类化合物，因其口味接近蔗糖，作为绿色低热量高倍甜味剂，已广泛应用于食品及医药业[1]。

作为甜菊糖苷类化合物的主要提取原料，甜叶菊叶片所含化学组分复杂，在甜叶菊叶片品质评估及甜菊糖提取工艺控制中，由于样品多、检测任务重，为有效替代人为及系统误差大、处理效率低、操作繁琐的液液萃取、固相萃取(SPE)等现有前处理方法，迫切需要建立一种简便快捷、易与现有检测体系相结合且不影响色谱柱耐用性和样品稳定性的前处理方法。在前期研究中，本实验室建立了一种利用酸性氧化铝“同步吸附”处理甜叶菊叶片提取液样品前处理方法，HPLC-UV检测结果表明，在甜菊糖苷类化合物检测所使用的210 nm处，该方法可使样品中保留时间小于RA者（在前述研究中将此部分统称为“非糖苷类杂质”，但含有RD、RM等在前述研究材料中含量甚微的甜菊糖苷）总检出峰面积减少65.0%以上，而对RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量影响小于3.0%。前期分析结果表明，该方法有助于便捷地开展甜叶菊种质甜菊糖苷特性评估及甜菊糖苷提取加工工艺控制的在线检测[2]。

由于甜叶菊叶片中甜菊糖苷种类繁多，受研究材料限制，前期只对RA和STV两种甜菊糖苷组分进行了分析，未对当前应用中较为关注的RD、RM等化合物进行检测；同时，前期所依托的HPLC-UV检测系统只对210 nm处有吸收的化合物进行了检测。质谱分析法对化合物的检测具有不依赖波谱吸收特性，检测灵敏度高、定性和定量分析结果准确等特性，随着甜叶菊甜菊糖苷类化合物的应用开展，应用领域对甜叶菊叶片中甜菊糖苷的种类及其含量特性提出了更高要求，甜叶菊育种及甜菊糖苷提取加工都迫切需要借助UPLC的线速度、流速等优势来提高检测效率、强化提取工艺监控、加快育种进程。为此，本研究以RE、RD和RM相对含量较高的甜叶菊新品系为材料，在建立甜叶菊叶片样品各甜菊糖苷组分的UPLC分离体系基础上，利用UPLC-MS就酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片浸提液样品中甜菊糖苷和非甜菊糖苷类化合物检出情况进行分析，促进酸性氧化铝前处理和UPLC-MS检测体系在甜菊糖苷提取用甜叶菊种质评估及甜菊糖苷提取加工工艺控制中的应用。

1 仪器、材料与方法

1.1 实验材料

为探讨酸性氧化铝前处理对甜叶菊叶片浸提液样品中各甜菊糖苷，特别是RE、RD和RM等目前生产上较为关注的甜菊糖苷的影响，以本实验室2016年选育成功的RE、RD和RM相对含量较高的甜叶菊（S.rebaudiana）新品系‘1066’为材料，材料种植于江苏省南京市江浦县的南京农业大学园艺试验站内。

1.2 材料的处理

于现蕾期取叶片，直接于80℃烘干（样品组1）或经青贮处理[3]后80℃烘干（样品组2～4），并参照罗庆云[4]等方法准备样品备用。

1.3 酸性Al2O3的制备及提取液的前处理

参照罗庆云等[2]方法进行酸性Al2O3的制备，并采用“同步吸附法”制备提取液样品。同时设未添加酸性Al2O3吸附的提取液对照样品。

1.4 标准品

甜菊糖苷标准品莱鲍迪苷D（Rebaudioside D,RD）、莱鲍迪苷M（Rebaudioside M,RM）、莱鲍迪苷A（Rebaudioside A,RA）、甜菊苷（Stevioside,STV）、莱鲍迪苷F（Rebaudioside F,RF）、莱鲍迪苷C（Rebaudioside C,RC）、杜克苷A（Dulcoside A,DA）、甜茶苷（Rubusoside,Rub）、莱鲍迪苷B（Rebaudioside B,RB）和双糖苷（Steviolbioside,SB）等标准品购于ChromaDex，用含30%（v/v）乙腈的水溶液溶解，由诸城浩天药业有限公司馈赠。

1.5 甜菊糖苷的液质联用分析器材及方法

分析用耗材：色谱柱ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,粒径2.5µm）(广州菲罗门科学仪器有限公司)；甲酸（ROE,LCMS级）；乙腈（Tedia company Inc,absolv）；去离子纯化水。

分析用仪器：液质联用仪Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-QTOF MS，质谱检测器ESI离子源负离子模式；毛细管电压3500 V；干燥器温度350℃、流速10 mL/min；雾化器压力50 psi；Mass range 100～2000 m/z；Fragment voltage 195 V；为配合质谱分析，用分流器将实际进入检测系统的流速调整为0.6 mL/min。

2 结果与分析

2.1 液质联用建立适宜甜菊糖苷各组分分析的UPLC分离体系

在质谱仪支持下，可快速定位与各标准品对应的甜菊糖苷组分的保留时间。但是，由于已有的检测体系是以磷酸盐缓冲液为pH调节剂的，不适用于质谱检测仪，本研究以乙酸为pH调节剂，建立了适宜于质谱仪的甜叶菊叶片甜菊糖苷组分分析的UPLC分离体系。

研究结果表明，在以ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,粒径2.5µm）为固定相、乙腈(B)和含0.1%（v/v）甲酸(A)的纯净水为流动相条件下，实现甜叶菊叶片样品甜菊糖苷各组分有效分离的洗脱梯度条件为：0 min 27%B；3.5 min 38%B；4.2 min 38%B；4.21 min 100%B；8 min 100%B；8.01 min 27%B。其他相关条件为：进样量5µL、柱温50℃、流动相总流速1.5 mL/min、二极管阵列检测器（DAD）检测波长210 nm。

在本研究条件下，在可通过标准品明确的10种甜菊糖苷中，除RA和STV未能实现基线分离外，各已知及无标准品对应而未明确甜菊糖苷组分间分离较好，都实现了基线分离，各甜菊糖苷组分保留时间先后顺序与基于C18柱的JECFA一致，顺序为RD、RM、RA、STV、RF、RC、DA、Rub、RB和SB，相应保留时间分别为1.847、2.113、3.373、3.460、3.773、3.953、4.093、4.553、4.987和5.153 min（图1）。在此条件下，包含样品间柱子清洗、再平衡等操作在内，可实现每10 min检测一个样品，与在HLPC上梯度洗脱检测一个样品需要近60 min相比，检测效率明显提高。

图1甜叶菊叶片10种常见甜菊糖苷组分的UPLC分离Fig.1 UPLC separation of ten common steviol glycosides from leaves of stevia

2.2 酸性氧化铝处理对非甜菊糖苷类化合物检出的影响

酸性氧化铝处理明显提高了样品的澄清度（图2），在本研究所采用的超高压高效液相分离条件下，非糖苷类极性杂质的保留时间多小于1.7 min，非极性杂质的保留时间多大于5.4 min。从图3的离子流图可以看出，与未处理者相比较，酸性氧化铝处理后，保留时间小于1.7 min的化合物离子流明显减少，对保留时间大于1.7 min者，除保留时间为3.708和3.850者离子流减少明显外，对其他组分离子流影响不明显。

图2酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片提取物色泽及透明度的影响Fig.2 Effect of acid Al2O3treatment on color and transparency of extract of stevia leaf

图3酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片提取物总离子流（TIC）的影响Fig.3 Effect of acid Al2O3treatment on total ion current(TIC)of extract of stevia leaf

酸性氧化铝对黄酮、酚类及蒽醌等酸性化合物具有较强的亲和性，这3类化合物分别在255 nm、274 nm和330 nm左右有特异性吸收。为初步确定甜叶菊叶片甜菊糖苷组分分析样品经酸性氧化铝处理后所去除的化合物种类，分别在255±2 nm、274±2 nm和330±2 nm（图4）处对酸性氧化铝处理前后的样品进行了扫描分析。结果表明，经酸性氧化铝处理后，与未处理者相比，上述3个波段下所检出化合物的量多下降至30%以下（表1）。

图4酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片提取物在255、274、330 nm检出物的影响Fig.4 Effect of acid Al2O3treatment on detectable compounds at 255,274 and 330 nm in extract of stevia leaves

表1 酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片提取液255nm、274nm和330nm下化合物相对检出量（%）的影响*Table 1 Effect of acidic Al2O3treatment on relative detection(%)of detectable compoundsat 255,274 and 330 nmin stevia leaf extract

2.3 酸性氧化铝处理对甜菊糖苷类化合物检出的影响

与未处理者相比，酸性氧化铝处理后，RE、RD、RM、RA、STV、RC和RB等甜菊糖苷组分ESI相对值都为100%左右，表明上述甜菊糖苷组分对酸性氧化铝处理的稳定性强。相对地，RF、Rub两种甜菊糖苷的ESI相对值波动较大，酸性氧化铝处理后，ESI检出值都出现了不同程度的上升，这可能是由于酸性氧化铝处理时酸根离子的引入导致甜叶菊叶片提取液中某些本研究未检测的甜菊糖苷类化合物的降解形成RF和Rub所致（表2）。

表2 酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片各甜菊糖苷组分的ESI相对值（ESI）、OD210nm相对值（OD210nm）及OD210nm值对ESI值相对代表率（OD210nm:ESI）的影响*Table 2 Effect of acidic Al2O3treatment on relative value of ESI(ESI),relative value of OD210nm(OD210nm)and relative representative rate of the value of OD210nmto the value of ESI(OD210nm:ESI)of 9 main steviol glycosides in extract of stevia leaves

此外，表2结果还显示，与未处理者相比，酸性氧化铝处理后，甜叶菊叶片提取液中RD、RM等8种主要甜菊糖苷组分的OD210nm值都表现为不同程度的降低，相对地，210 nm处单位吸收峰面积对ESI值的表征率得到了较为明显的提高，RF、RC和Rub三种甜菊糖苷的OD210nm值对ESI值相对代表率为未处理者的1.6～2.1倍，表明酸性氧化铝处理较为明显地降低了整个分离体系中在210 nm处有吸收化合物的量，使各组分在其保留时间处流份的相对纯度得以提升。

3 讨论与结论

有效的样品前处理包括：1）减少杂质的引入，降低杂质对检测体系的影响，降低对分离体系的要求，提高检测效率；2）减少对目标检测组分理化性质的影响，提高目标化合物的稳定性，确保检测结果的可靠性。

作为第三代糖源，甜叶菊叶片富含甜菊糖苷类天然低热高倍甜味物质。甜菊糖苷为其叶片形成和积累的以四环二萜类化合物——甜菊醇为母核的糖苷类化合物，该类化合物因连接在甜菊醇母核13位和19位羟基上糖的种类、连接方式及连接顺序不一而导致其空间位阻不同，使其与口腔味蕾的结合及分离特性存在差异，表现为不同的口感[5-7]。到目前为止，人们已经对甜叶菊叶片内天然形成的50种以上甜菊糖苷进行了分离、鉴定和口感评价。

育种改良甜叶菊叶片内目标甜菊糖苷形成能力；栽培管理实现甜叶菊叶片内目标甜菊糖苷的有效积累；提取加工实现甜叶菊叶片所含甜菊糖苷类化合物的分离；复配应用实现甜菊糖苷优良特性的有效应用。在以甜菊糖苷为标的物的甜叶菊产业活动中，对包括甜叶菊叶片在内的所有物料甜菊糖苷组分的全面评价和有效利用是产业得以良性发展的核心技术。

虽然甜叶菊叶片中甜菊糖苷的总量可达到叶片干重20%以上，但还存在以下问题：1）这是一个整体概念，这对以口感为核心的甜菊糖苷的应用借鉴意义不大，关键的是需要明确RE、RD、RM等口感优良的高品位甜菊糖苷及RC、RF、STV、Rub等口感较差的低品位甜菊糖苷在包括甜叶菊叶片在内各物料中的绝对和相对含量，为育种、栽培、分离及应用提供依据；2）甜叶菊叶片所含与目标甜菊糖苷理化性质相近的化合物种类繁多，干扰了产业人员对目标甜菊糖苷的有效检测，严重影响了甜叶菊育种、栽培、分离及复配理论及技术体系的建设和完善。此外，作为新型甜味剂，甜叶菊源甜菊糖苷在食品及医药业[8-9]的应用范围日益广泛，这对育种、栽培、分离、应用及市场监管等环节提出了挑战。

为有效应对日益繁重的检测任务，本实验室围绕甜叶菊种质评价及甜菊糖苷分子育种所需，长期致力于建设一种简便快捷、易与现有检测体系相结合且不影响样品稳定性和色谱柱耐用性的前处理方法。在前期研究中，本实验室基于HPLC-UV评估并建立了一种利用酸性氧化铝“同步吸附”处理甜叶菊叶片提取液样品前处理方法，该方法有助于便捷地开展甜叶菊种质甜菊糖苷特性的评估及甜菊糖苷提取加工工艺控制的在线检测。

随着甜叶菊甜菊糖苷类化合物的应用开展，应用领域对甜叶菊叶片中甜菊糖苷的种类及其含量特性提出了更高要求，甜叶菊的育种及甜菊糖苷的提取、复配和应用都迫切需要借助UPLC的线速度、流速等优势来提高检测效率、强化工艺监控、加快育种进程。质谱分析法对化合物的检测具有不依赖波谱吸收特性，检测灵敏度高、定性和定量分析结果准确等特性[10]，本研究以RE、RD和RM相对含量较高的甜叶菊新品系为材料，在甜叶菊叶片样品各甜菊糖苷组分UPLC分离体系建立的基础上，利用UPLC-MS进一步就酸性氧化铝处理对甜叶菊叶片浸提液样品中甜菊糖苷和非甜菊糖苷类化合物检出情况进行了分析。结果表明，甜菊糖苷组分对酸性氧化铝处理的稳定性强，检测结果可靠性高；酸性氧化铝对黄酮、酚类及蒽醌等化合物具有较强的亲和性，甜叶菊叶片提取物经酸性氧化铝处理后，黄酮、酚类及蒽醌等检出量多下降至30%以下，降低了整个分离体系中210 nm处有吸收化合物的量，使RE、RD、RM、RA、STV、RC、RF、Rub等各组分在其保留时间处流份中的相对纯度得以提升，提高了甜菊糖苷检测值的准确度。这些结果是对前期研究的验证，揭示了甜叶菊叶片提取物经酸性氧化铝处理后可有效去除非甜菊糖苷杂质，对甜菊糖苷检测有利，对在甜叶菊种质甜菊糖苷形成特性评估、甜菊糖苷分离提取工艺控制及甜菊糖苷的复配应用等场景所需检测样品的前处理中的应用将起到推动作用。

致谢：印敏负责UPLC-MS相关实验方案设计、数据采集并对数据的分析提出参考意见；陈玉江、缪慧敏、陈婉婷和谭曦曦等参与实验材料繁育；陈爱彦和刘福凤负责实验材料田间管理。