镉逆境胁迫下甜菜BvHIPP24基因在大肠杆菌的功能分析

鲁振强，王锦霞，，董大鹏 ，，张司扬，刘大丽

（1.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080；2.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；3.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨150025）

0 引言

金属伴侣蛋白（Metallochaperones）是一类细胞质可溶蛋白，它通过参与结合重金属离子，以阻止金属与其它细胞组分发生毒害反应，同时，帮助细胞安全地运输金属离子[1-2]。在植物细胞中，Metallochaperones是参与重金属逆境胁迫和离子安全转运最为关键的蛋白家族之一。迄今为止，在藻类、真菌以及动物细胞中，仅发现了数量有限的金属伴侣蛋白；与之相反的是，在植物体内，Metallochaperones却拥有庞大的家族，总体上来说，这类蛋白被分为两大类：第一类是重金属关联植物蛋白（Heavy metal-associated plant proteins，HPPs）；第二类是重金属关联异戊二烯化植物蛋白（Heavy metal-associated isoprenylated plant proteins，HIPPs）[3-4]。其中 ，HIPPs的 独特 特性是 由其 重金属 结合域（heavy metal associated domains，HMA，pfam00403.6）以及异戊二烯化序列（isoprenylation motif）决定的。大多数HIPPs的HMA和isoprenylation motif之间还存在着一个灵活的富含甘氨酸的区域[3,5]。HMA具有一个核心氨基酸序列结构M/L/IxCxxC，并且拥有两个保守的半胱氨酸残基以参与重金属离子的结合[6]。在动物、酵母、细菌和某些植物体内，一些HMA的结合基团特异的螯合Cu，并参与Cu的离子平衡[7]。除了Cu以外，HMA结构域被发现还拥有镍或者锌等的结合活性[6,8]。不同物种体内的HMA-containing proteins在包括重金属Cd在内的运输以及离子代谢平衡方面发挥着至关重要的作用。

异戊二烯化（Isoprenylation）是在细胞质中发生的一种翻译后蛋白修饰作用。这种修饰作用过程是在蛋白质C端具有CaaX框架蛋白质的半胱氨酸基团的巯基上增加15个carbon farnesyl或者20个carbongeranylgeraniol[4,9]。而翻译后修饰可以彻底地改变蛋白质的功能和特性，进而在植物逆境生理中发挥作用[1]。尽管HMA domain以及异戊二磷酸化过程各自在很多生物体中比较常见，但两种结构同时存在于一种蛋白中却仅在植物中被发现[6]。这种特殊的结构可以使植物HIPPs基因家族通过重金属离子平衡调控在解毒机制中发挥作用（特别是在Cd的耐受性方面）[4-5,8,10]。1999年，研究人员首次发现HIPPs蛋白具有结合Cu2+、Ni2+、Zn2+的能力[6]，随后的研究发现，HIPPs还可以结合Cd、Hg、Pb等重金属离子，但对Co、Mn、Ca没有特异结合能力[5,8]。而在植物中，迄今为止仅有很少一部分HIPPs基因得到研究，并且研究主要集中在拟南芥这种模式植物中。

在研究小组前期对能源甜菜在Cd逆境胁迫下转录组学等的研究中发现[11]，甜菜BvHIPP24的上调表达差异对于不同浓度Cd的逆境响应极为显著，推测该基因很有可能在镉的解毒代谢以及区隔化中扮演着重要的角色。因此，本研究以BvHIPP24——甜菜重金属关联的异戊二烯蛋白基因为研究对象，通过基因克隆以及大肠杆菌原核表达，体外分析该基因在重金属镉逆境胁迫下的作用机制和功能，为研究和开发能源甜菜独特的耐重金属基因资源提供候选基因，也为利用能源甜菜进行重金属污染生物修复以及生物质能研发奠定良好的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甜菜种子780016B/12优，由国家甜菜种质资源中期库（国家甜菜种质资源平台）提供。称取1 g甜菜幼苗植物组织，用于总RNA的提取以及基因克隆。

1.2 实验方法

1.2.1RNA的提取

本研究利用Trizol法提取甜菜的总RNA。分别利用紫外分光光度计NavoVue plus在OD260和OD280下以及1.0%琼脂糖凝胶，检测RNA浓度和纯度。

1.2.2RT-PCR

根据甜菜Beta vulgaris heavy metal-associated isoprenylated plant protein24（BvHIPP24，LOC104905684）基因的碱基序列设计引物：[Forward primer(5′-3′):ATG GGA GTA CAA GGA ACT TTG GAA；Reverse primer(5′-3′):CCG CTC GAG(XhoI)CTA CAT AATATAACAAGC ACC]。以First strand cDNA synthesis kit（TOYOBO）反转录的cDNA为模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO）PCR扩增目的基因全长。

1.2.3 大肠杆菌原核表达重组载体的构建

取4µL PCR产物，于25℃连接到pEASY-Blunt E1载体（TransGen）上，并转化到Trans1-T1感受态细胞中。提取Amp抗性阳性克隆质粒DNA，并利用XbaI和XhoI对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定。所获得的阳性克隆进一步于上海生工测序，确定其碱基序列的完整性。

1.2.4 融合蛋白诱导表达

将重组质粒（pEASY-Blunt E1-BvHIPP24）以及对照质粒（pEASY-Blunt E1）分别转化到大肠杆菌BL21中。挑取重组菌株以及对照菌株单克隆，培养于2xYT+Amp培养基中。加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，诱导His-tag融合蛋白的表达。分别于0、30、60、90、120、180和240 min收集菌液，提取菌液粗蛋白；利用SDSPAGE进行蛋白质变性凝胶电泳检测。

1.2.5 镉逆境下大肠杆菌生长曲线的测定

分别在OD600=0.1的重组菌以及对照菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG以及0.5 mmol/L的CdCl2，以未施加镉逆境处理的菌株为条件处理对照，37℃、180 r/min振荡培养，每隔2个小时测定OD600值，重复3次实验，绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 甜菜BvHIPP24基因RT-PCR扩增

根据Beta vulgaris heavy metal-associated isoprenylated plant protein24（BvHIPP24，LOC104905684）基因的碱基序列，以及大肠杆菌原核表达载体pEASY-Blunt E1的His-tag融合蛋白读码框顺序设计特异引物，以较高纯度和质量的甜菜总RNA（图1-A）反转录的cDNA为模板，利用高保真Taq酶PCR扩增目的基因。经过琼脂糖凝胶电泳的检测，RT-PCR扩增后，在445 bp左右的位置获得了目的条带（图1-B）。此PCR产物与BvHIPP24基因预测的CDS区域的序列大小一致。

图1甜菜BvHIPP24基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of BvHIPP24 gene

图2 pEASY-Blunt-BvHIPP24重组质粒的XbaI和XhoI限制性内切酶酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid of pEASYBlunt-BvHIPP24 by restricted enzyme XbaI and XhoI M(Marker):Trans2K Plus II DNA marker(TransGen)

2.2 pEASY-Blunt E1-BvHIPP24重组载体的构建

将PCR扩增获得的BvHIPP24基因片段连接到大肠杆菌表达载体pEASY-Blunt E1上。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞中，并对阳性克隆的重组质粒进行XbaI和XhoI限制性内切酶酶切鉴定。研究发现，在Agarose凝胶的5 716 bp和445 bp左右的位置上，获得了相对应于载体pEASY-Blunt E1和目的基因片段BvHIPP24的条带（图2）。将重组质粒pEASY-Blunt E1-BvHIPP24测序，发现该基因被正确地扩增并插入到pEASY-Blunt E1载体内部。

图3 SDS-PAGE下，大肠杆菌体内His-tag-BvHIPP24融合蛋白的表达Fig.3 Expression of His-tag-BvHIPP24 fusion protein in E.coli by SDS-PAGE

2.3 甜菜BvHIPP24基因在大肠杆菌体内的表达分析

将重组质粒pEASY-Blunt E1-BvHIPP24转化到BL21中，利用1 mmol/L IPTG诱导表达甜菜BvHIPP24融合蛋白。如图3所示，在SDS-PAGE中，未受到诱导的菌液粗蛋白中未发现目的基因所编码蛋白的表达（lane1）；而随着诱导的开始和时间的增加，在lane2～7中，18 kDa左右的位置出现了与His-tag融合蛋白大小相一致的片段。这说明，通过IPTG诱导物的诱导，甜菜BvHIPP24基因在大肠杆菌体内被正确地表达和翻译。

图4镉逆境胁迫下，BvHIPP24基因表达的大肠杆菌的生长曲线分析Fig.4 Growth curve of E.coli expressing BvHIPP24 gene under Cd stress

2.4 镉逆境胁迫下BvHIPP24基因在大肠杆菌体内的功能分析

以转化pEASY-Blunt E1空载体的菌株为对照，对表达BvHIPP24的重组菌在镉逆境下的生长状态进行了比较分析。结果（图4-A）表明，在正常生长条件下，重组菌和对照菌的生长曲线的趋势几乎一致。与之相反的是，加入0.5 mmol/L CdCl2后，对照菌的生长受到了严重的抑制，几乎无法正常生长；而表达BvHIPP24的重组菌却表现出了优于对照菌株的生长状态，可以在一定程度上耐受Cd逆境的胁迫（图4-B）。因此可以推断，甜菜BvHIPP24基因在大肠杆菌抵御重金属镉的毒害中发挥着重要作用。

3 讨论

重金属镉毒害通过抑制细胞功能物质合成，破坏蛋白酶功能等，阻碍植物生长，甚至导致植物细胞死亡[12]。在植物的重金属逆境调控机制中，对于重金属离子的结合、转运甚至是区隔，是细胞解毒机制的重要一环。金属伴侣蛋白在植物细胞运输重金属离子方面发挥着重要作用。它们通过与金属离子的紧密结合以及蛋白质互作，来促进离子交换以及特异转运，从而防止重金属对细胞的破坏[1]。重金属关联异戊二烯化植物蛋白由于其独特的金属结合域和羧基末端的CaaX异戊二烯化蛋白基序的存在，成为金属伴侣蛋白家族中最为重要的成员之一[3,6]。

通过前期对甜菜在重金属Cd逆境胁迫下的转录组测序发现，甜菜BvHIPP24基因的转录表达受到了Cd逆境胁迫的强烈诱导，这也暗示了该基因参与到甜菜抗重金属逆境胁迫机制过程中。为了验证和分析BvHIPP24的应答特性，本研究通过RT-PCR克隆了BvHIPP24，并通过外源基因重组的方式，将其诱导表达于大肠杆菌中，通过对重组菌的镉逆境处理，发现该目的基因的大量表达可以在一定程度上提高大肠杆菌对Cd的耐受性。因此研究结果进一步佐证了BvHIPP24在甜菜的重金属耐受分子机制中的关键作用。同样通过体外表达的方式，在Gao等的研究中发现，HIPP26可以络合Cd2+、Cu2+、Pb2+，并且过量表达的AtHIPP26大大地提高了拟南芥对Cd的耐受性[5]。而在酵母体内，通过表达AtHIPP20、AtHIPP22、AtHIPP26以及AtHIPP27蛋白，使得酵母在Cd敏感型和Cd耐受型之间发生了转变[4]。而这种抗性的变化可能主要是由于细胞质结合的Cd离子要远多于Cd在液泡中的区隔以及细胞外的运输。这些研究结果也进一步说明了HIPPs家族成员具备了在植物体内结合Cd的能力，并在植物的整个Cd离子解毒网络机制中发挥着重要的作用。而在甜菜体内，BvHIPP24基因独特的Cd2+分子机理还有待于进一步的研究。