提高大学生科学探究实践的案例设计与分析——《以革兰氏染色方法及机理》为例

邓振山，赵瑞华，贺晓龙，刘月芹

(延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000)

促进学生自主创新能力的培养，全面推进人才培养模式的综合改革，尤其是培养学生的自学能力和创新精神已成为目前我国高等教育改革的核心问题[1]。微生物学是生物科学专业的一门重要的专业基础课程，同时它也是实践性很强的一门学科，在高等院校的生物科学、生物技术和生物工程及农、林、医、环境等专业的教学计划中占有很重要的地位。微生物学的知识和技能在当今社会的诸多领域中的应用十分广泛，因此，高水平学校的微生物教学体系对于培养和提高学生的探究能力、创新精神和整体素质具有十分重要的意义[2]。鉴于此，本文以课堂教学案例的形式阐释在本科课堂教学过程中如何培养学生的探究能力和创新意识，旨在倡导教师在平时的教学过程中有意识地注重大学生探究能力和科学思维能力的培养。在讲授时，按照科学探究的方法，引导学生通过采用分组讨论方式，完成探究过程。具体过程为：(1)观察现象，提出问题(什么？为什么？如何？)；(2)提出科学假说(以解释所观察到现象内部深藏的机理和内在规律)；(3)设计科学实验方案，验证科学假设是否成立；(4)最后形成理论，并修改完善假说。

1 观察现象，提出问题

革兰氏染色(Gram Staining)是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性(Gram Positive)与革兰氏阴性(Gram Negative)。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰(Hans Christian Gram，1853年-1938年)于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。后推广为鉴别细菌种类的重要特性之一，对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗有着广泛用途。

给学生强调革兰氏染色法是其可将所有细菌染色的重要方法。其染色要点：先用结晶紫染液染色，再加媒染剂—碘液处理，使菌体着色，然后用乙醇脱色，最后用复染液(沙黄或番红)复染。显微镜下菌体呈红色者为革兰氏染色阴性细菌(常以G-表示)深紫色者为革兰氏染色阳性反应细菌(常以G+表示)。

具体通过G+菌(金黄色葡萄球菌)与G-菌(大肠杆菌)为例介绍染色的具体步骤及结果，创设情境让学生首先从感官上先感受G+菌与G-菌染色的结果的差异，展示的效果见图1和表1。

图1 革兰氏染色法的步骤及结果图

步骤方法结 果阳性(G+)阴性(G-)初染结晶紫30 s紫色紫色媒染剂碘液30 s仍为紫色仍为紫色脱色95%乙醇10～20 s保持紫色脱去紫色复染蕃红(或复红)30～60 s仍显紫色红色

在此基础上，启发学生去思考所有的细菌经过革兰氏染色，为什么能被染成两种不同颜色？其内在的原因和机理是什么？还要给学生强调，此答案是在革兰氏染色法发明后的一百多年，经过几代科学家的不懈努力才找到其染色原因及机理，以此来激励学生在科学的道路上，要不断的坚持和探索，最终才能找到科学的真谛。

2 提出科学假说

继续引导学生去思考和探究，学生可以利用空余时间自由组合成讨论小组，结合自己对提出问题的理解，有针对性的开展自主查阅与问题内容有关的文献，提出相应的科学假说，如：之所以出现两种不同的染色结果可能存在外在因素和内在因素影响所致。具体的是(1)认为是外在因素影响，即由于不同的染色步骤反应的差别引起的，同学们就提出同一株菌株如果改变染色步骤或染色时间会染成不同颜色的假说；(2)认为是内在因素影响的，却提出染色结果的差异是由于两类细菌的细胞外膜结构的差异所致的假说。

3 设计科学实验方案

学生依据各自提出的假说，撰写实验实施方案，自己动手做实验进行验证所提出的假说是否科学。在实验过程中，要求学生认真做好实验记录，并对数据进行整理和分析。如认为是内在因素影响的，也就是说染色结果的差异是由于两类细菌的细胞外膜结构的差异所致的同学，要想搞清其染色机理，首先必须要阐释G+菌与G-菌细胞壁的化学组成结构差异所在。为此，该组学生去思考并找出革兰氏阳性细菌(Gram positive)和革兰氏阴性细菌(Gram negative)细胞壁的化学组成与超微结构的差异所在：

(1)革兰氏阳性细菌

革兰氏阳性细菌细胞壁具有较厚(30～40 nm)而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁的成分60%～90%，它同细胞膜的外层紧密相连(见图2)。有的革兰氏阳性细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoi-acid)，也即胞壁质(murein)。

图2 革兰氏阳性菌细胞壁结构图

(2)革兰氏阴性细菌

革兰氏阴性细菌特殊的是外膜上含有许多独特的结构(见图示3)，如把外膜与肽聚糖层连接起来的布朗(Braun′s)脂蛋白，使营养物被动运输通过膜的膜孔蛋白和起保护细胞作用的脂多糖(LPS)。脂多糖也称为内毒素，对哺乳动物有高度毒性。

图3 革兰氏阴性菌细胞壁结构图

G-细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，此外还有磷脂、多糖、和蛋白质。外膜被分为脂多糖层(外)、磷脂层(中)、脂蛋白层(内)。

1)肽聚糖层：G-细菌细胞壁肽聚糖层很薄，约有2～3 nm厚。它与外膜的脂蛋白层相连。

2)周质空间：周质空间(periplasmic space，即壁膜间隙)是革兰氏阴性细菌细胞膜与外膜两膜之间的一个透明的区域(见图2)。它含有与营养物运输和营养物进入有关的蛋白质，有：营养物进入细胞的蛋白；营养物运输的酶，如蛋白水解酶；细胞防御有毒化合物，如破坏青霉素的-内酰胺酶。革兰氏阳性细菌以上这些酶常分泌到胞外周围，革兰氏阴性细菌则依靠它的外膜，保持这些酶与菌的紧密结合。因此，在此基础上，通过查阅相关文献和小组讨论，依据革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌细胞壁结构的差异，设计出通过改造革兰氏阴性细菌细胞壁结构的方法，即通过加入十二级磺酸钠(SDS)等表面活性剂以去除革兰氏阴性细菌细胞壁最外层脂多糖，高速离心，取细胞体进行革兰氏染色，看结果有无变化，从染色结果的变化推断出染色的差异是由于两种菌株的细胞壁结构差异所致的结论。

4 修改完善假说

最后学生经过探究和思考，并讨论最终获得革兰氏染色机理如下：固定过的细胞经过初染，例如结晶紫染色，接着加碘液媒染，细菌细胞壁内由于染色形成结晶紫与碘的复合物。随后加酒精从薄的细胞壁中洗出结晶紫与碘暗染色的复合物，但是结晶紫—碘复合物不能从厚的细胞壁中洗出。最后，用较浅的石炭酸复红复染。加石炭酸复红染色，使脱色的细胞呈粉红色，但在含厚的肽聚糖暗染色的细胞中没有看到粉红色，仍保持第一次的染色结果。保持原来染色(厚的细胞壁)的细胞称作革兰氏阳性，在光学显微镜下呈现蓝紫色。脱色的细胞(薄的细胞壁和外膜)称作革兰氏阴性，染成粉红色。

5 结语

通过这样的探究过程，使学生明白科学的探究全过程，依靠自己去思考、去探究、去验证想法，这极大地激发了学生们的创造能力，也让课堂更生动更有活力。从而，经过学生的积极思考和主动参与，在教师主导作用下，潜默移化地培养了学生科学探究能力，激发了创新意识。还可以激发学生对科学研究的积极性，在本科学习中营造浓厚的学术氛围，充分调动学生认知客观世界的能力，同时将教学和科研紧密结合。

经过科学探究能力的培养，近2年来“陕北地区原油污染土壤的微生物修复技术”等30多个项目先后获得国家级“大学生创新创业训练计划”计划项目的立项，本科生毕业发表的微生物学相关的学术论文20余篇，并2次获得全国大学生互联网+大赛省级银奖和铜奖。同时，通过科学探究意识的训练和创新实践能力的培养，真正使个人科学素养培养落到实处，并使学生终身受益。让学生在巩固理论知识的同时，培养了学生科研创新思维能力。

因此，通过教学实践模式表明，将科学探究过程融入到基础微生物学教学过程的目的是激发学生科学研究和探索的积极性和主动性，使其更好地掌握微生物学基本理论，并培养学生科学思维能力。