基于纳米金-罗丹明B体系荧光增强检测阿米卡星

王 睿，田 锐，刘航航，张美琪，何思媛

(延安大学 化学与化工学院；延安市分析技术与检测重点实验室，陕西 延安 716000)

阿米卡星(Amikacin)，是一种氨基糖苷类抗生素，在临床上主要用于治疗多种耐药菌感染，由于阿米卡星有一定毒副作用，因此对其用量要有严格的控制，采取合适的方法对其进行检测也尤为重要[1]。由于阿米卡星自身无特征紫外吸收，所以不能直接采用传统HPLC(紫外)进行检测，《中国药典》2010年版二部[2]规定采用HPLC-柱前衍生化法对其进行检测。文献报道测定阿米卡星的方法有：旋光法、液相色谱-质谱法、光度法、电化学法、化学发光分析法、荧光法等[3-8]。荧光分析法由于仪器设备简单、测定灵敏度高而在分析检测中备受关注，但文献报道的荧光分析法存在荧光探针制备复杂、络合物稳定性差等问题，因此，发展新的简单稳定的荧光分析法具有重要意义。

金纳米粒子(纳米金，AuNPs)具有独特的光学性质，当纳米金与荧光物质作用时，会由于彼此间距离及纳米金尺寸的不同产生不同的荧光猝灭效应[9]，基于纳米金与荧光物质的这一作用，纳米金-荧光染料体系被广泛应用于基因、药物等的分析检测[10，11]。本文基于分散态纳米金对罗丹明B的荧光猝灭作用强于聚集态纳米金及阿米卡星对纳米金的诱导聚集作用，通过向纳米金-罗丹明B(AuNPs-RhB)体系中加入阿米卡星使纳米金聚集体系荧光信号增强，建立了基于AuNPs-RhB体系荧光增强测定阿米卡星的荧光分析新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2700型荧光分光光度计(日本日立公司)，TU1901紫外-可见分光光度计(普析光学仪器有限公司)。

氯金酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，柠檬酸三钠、罗丹明B(分析纯，西安化学试剂厂)，阿米卡星(标准品，中国药品生物制品检定所，0904031105)，其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 AuNPs的制备

AuNPs按文献方法制备[12]︰取50.00 mL 1.0 mmol/L的氯金酸于圆底烧瓶之中，加热至回流后快速加入5.00 mL 38.8 mmol/L的柠檬酸钠，继续回流15 min后去掉加热器，冷却过滤后置于棕色瓶于冰箱中4℃存放备用。

1.3 实验方法

取1.00 mL RhB(1.0×10-5mol/L)和1.00 mL AuNPs置于比色管内，将其摇匀，静置作用15 min后稀释定容至10 mL，得AuNPs-RhB测试液。取2.00 mL AuNPs-RhB测试液于10 mL比色管中，加入阿米卡星静置反应15 min后用超纯水定容至5 mL，测定其荧光强度(对照组荧光信号值记为F0，样品组荧光信号值记为F)，根据阿米卡星浓度与两者荧光信号差值ΔF(ΔF=F-F0)的关系对阿米卡星含量进行测定。

2 结果与讨论

2.1 阿米卡星与AuNPs-RhB体系作用的光谱研究

a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.AuNPs-阿米卡星;d.AuNPs-RhB-阿米卡星;e.RhB;f.RhB-阿米卡星;g.阿米卡星

图1吸收光谱

柠檬酸钠还原法制备的AuNPs带负电荷，通过静电排斥作用稳定分散[12]，RhB通过静电作用吸附在AuNPs表面，然后经过分子碰撞与能量转移使其荧光猝灭。当AuNPs发生聚集时，由于尺寸变大使得其对RhB的荧光猝灭程度减弱[13]，阿米卡星可与AuNPs作用使其发生聚集，从而使其对RhB的荧光猝灭作用减弱，体系荧光信号增强。为了验证这一实验原理，实验分别对AuNPs、RhB、阿米卡星、AuNPs-RhB、AuNPs-阿米卡星、RhB-阿米卡星和AuNPs-RhB-阿米卡星进行了光谱扫描，结果如图1所示。比较图中曲线a、b、c发现，向AuNPs中加入RhB后其吸收光谱在600 nm之后没有出现新峰，表明RhB不会与AuNPs作用使其发生聚集，而曲线c在600-750 nm出现的新峰正是聚集态纳米金的吸收峰，表明阿米卡星引起了AuNPs的聚集。曲线d(AuNPs-RhB-阿米卡星)中520 nm、570 nm及650 nm附近的吸收峰分别为单分散态纳米金、罗丹明B和团聚态纳米金，比较曲线c、d、e、f可发现罗丹明B与阿米卡星和纳米金都没有发生相互作用或化学反应，证明在AuNPs-RhB-阿米卡星体系中是阿米卡星与纳米金发生作用使其发生聚集。

实验同时对RhB、AuNPs-RhB及AuNPs-RhB-阿米卡星进行了荧光光谱扫描，结果如图2所示。图中曲线的峰形和最大发射波长一致，对比曲线a、c发现纳米金对罗丹明B有很强的荧光猝灭作用，比较曲线b、c则可发现加入了阿米卡星之后，体系的荧光明显有所恢复，这是因为加入了阿米卡星之后，引起了AuNPs的聚集，而聚集态的AuNPs对RhB的荧光猝灭作用不如单分散态AuNPs强。

a.RhB b.AuNPs-RhB-阿米卡星 c.AuNPs-RhB

图2荧光光谱

2.2 实验条件的选择

2.2.1 AuNPs与RhB的浓度和作用时间的选择

固定罗丹明B(1.0×10-5mol/L)为1.00 mL，分别加入0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.00、1.50和2.00 mL的AuNPs溶液，加超纯水定容至10 mL测定其荧光(图3)。结果显示随着AuNPs加入量的增加ΔF持续增大，加入1.00 mL AuNPs后ΔF增加趋缓，考虑到过量的纳米金会影响测定灵敏度，所以实验选择AuNPs与RhB的用量为体积比1∶1。

图3 AuNPs用量对体系荧光强度的影响

将AuNPs与RhB按体积比1∶1混合后放置不同时间，考察二者作用时间对荧光测定的影响，实验发现15 min后体系ΔF稳定。故确定罗丹明B(1.0×10-5mol/L)与AuNPs按体积比1∶1混合放置15 min得到稳定的AuNPs-RhB溶液。

2.2.2 AuNPs-RhB体系与阿米卡星作用时间的选择

向AuNPs-RhB溶液中加入阿米卡星，反应不同时间后进行测定，结果显示(图4)加入阿米卡星的前10 min体系ΔF持续增加，之后趋于平稳，这应该是10 min后体系中两种形态AuNPs达到平衡，为了保证体系的稳定性实验选择反应时间为15 min。

图4 AuNPs-RhB体系与阿米卡星反应时间对体系荧光的影响

2.2.3 反应温度的选择

将AuNPs-RhB溶液置于不同温度下，分别加入阿米卡星作用15 min后测定其荧光，实验发现随着温度升高体系ΔF持续降低(图5)，实验选择在室温(24℃)下进行测定。

图5 温度对体系荧光的影响

2.3 标准曲线与检出限

优化实验条件下，采用本方法对阿米卡星进行了测定，结果表明，在7.80×10-6～1.25×10-4mol/L浓度范围内体系的ΔF值与阿米卡星浓度呈良好的线性关系(如图6所示)，线性方程为ΔF=5.5×104c(mol/L)+60.1，相关系数r=0.997，检出限(S/N=3)为2.2×10-6mol/L。对1.0×10-5mol/L的硫酸阿米卡星标准溶液平行测定11次，其相对标准偏差(RSD)为2.7%。

a.7.80×10-6；b.3.00×10-5；c.5.00×10-5； d.7.00×10-5；e.1.00×10-4；f.1.25×10-4

图6标准曲线

2.4 干扰试验

在优化的实验条件下，考察了可能存在的常见干扰对阿米卡星测定的影响。当阿米卡星的浓度为1.0×10-5mol/L时(相对误差为±5%)，2000倍的生理盐水，1000倍的葡萄糖，800倍的Zn2+、Al3+、Mg2+、Ca2+、D-果糖，不干扰测定。

2.5 样品测定

取两支不同厂家的硫酸阿米卡星注射液，用超纯水稀释后按实验方法进行测定。测定结果表明，测定值与标识值基本一致。采用标准加入法测的样品回收率在97.2%～98.5%之间，表明该方法用于针剂中阿米卡星含量的测定结果准确。

表1 硫酸阿米卡星针剂中阿米卡星含量测定结果(n=5)

注：1.宜昌人福药业有限责任公司(批准文号H42021992)；2.成都通德药业有限公司(批准文号H51021294)。

3 结论

在AuNPs-RhB的混合体系中，AuNPs通过荧光共振能量转移使RhB的荧光猝灭，体系呈现弱荧光，阿米卡星的加入可使AuNPs产生聚集，由于聚集态AuNPs对RhB的荧光猝灭作用较弱，所以AuNPs-RhB体系的荧光有所增强，且增强程度在一定范围内与阿米卡星浓度成正比，据此确立了测定阿米卡星的荧光分析新方法。该方法对针剂中阿米卡星的测定结果令人满意，也有望用于人体用药后体液中阿米卡星的测定。