藏药赛北紫堇的质量标准研究

2019-10-10陈惟思汪晶杨忠辉项欠本索果佳曹鹏黄一平彭毛才让

中国医药导报 2019年21期

陈惟思汪晶杨忠辉项欠本索果佳曹鹏黄一平彭毛才让

[摘要] 目的建立藏药赛北紫堇的质量标准。方法采用薄层色谱法，以原阿片碱为对照品，测定10批赛北紫堇样品，并对其水分、灰分和浸出物进行测定;采用高效液相色谱法，以X-Bridge C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-三乙胺醋酸溶液（20∶80）为流动相，对赛北紫堇中原阿片碱进行含量测定;同时建立指纹图谱，计算相似度。结果 10批赛北紫堇药材的薄层色谱图有一个特征斑点。原阿片碱在质量浓度11.71～585.80 μg/mL范围内具有良好的线性关系，平均加样回收率为99.84%，RSD为2.75%。经高效液相色谱法指纹图谱分析，确立14个共有特征峰，相似度达到0.9以上。结论该方法简便、重复性好，可用于赛北紫堇质量控制。

[关键词] 藏药;赛北紫堇;原阿片堿;薄层色谱法;高效液相色谱法;指纹图谱;质量标准

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）07（c）-0116-04

Study on the quality standard of Tibetan medicine Corydalis impartiens

CHEN Weisi1 WANG Jing1，2 YANG Zhonghui3 XIANG Qianben3 SUO Guojia3 CAO Peng2 HUANG Yiping1，2 PENGMAO Cairang3

1.Department of Chinese Medicine Preparation， Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine Affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210023， China; 2.Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica， National Adninistration of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210028， China; 3.Hainan Tibetan Autonomous Prefecture Tibetan Hospital， Qinghai Province， Hainanzhou 813000， China

[Abstract] Objective To establish a quality standard for Tibetan medicine Corydalis impartiens. Methods Ten batches of Corydalis impatiens samples were determined by thin-layer chromatography with protoopioids as reference substance; the moisture content， ash content and extract were determined. The content of protopine in Corydalis impatiens was determined by high performance liquid chromatography with X-Bridge C18 column （250.0 mm×4.6 mm， 5 μm） and acetonitrile-triethylamine acetic acid solution （20∶80） as the mobile phase， meanwhile high performance liquid chromatography fingerprint was established and the similarity was calculated. Results The thin-layer chromatographyresults of 10 batches of Corydalis impartiens had one accurate characteristic spot. The original opioid has a good linear relationship in the mass concentration range of 11.71-585.80 μg/mL， the average recovery rate was 99.84% and the RSD was 2.75%. By high performance liquid chromatography fingerprint analysis， 14 common characteristic peaks were identified， and the similarity was above 0.9. Conclusion The method is simple， repeatable， which can be used for the quality control of Corydalis impatiens.

[Key words] Tibetan medicine; Corydalis impatiens （Pall.） Fisch.; Protopine; Thin-layer chromatography; High performance liquid chromatography; Fingerprint; Quality standard

赛北紫堇为罂粟科紫堇属植物北紫堇Corydalis impatiens（Pall.）Fisch.的干燥全草，具有活血散瘀、行气止痛、清热解毒功效，用于胃脘痛、肝炎、胆囊炎、疥癣、毒蛇咬伤等[1-2]。赛北紫堇的主要化学成分为生物碱类物质[3-5]，是其镇痛、抗炎、抗缺氧、抗氧化及抗肿瘤的有效成分[6-9]。目前赛北紫堇的药材标准研究缺乏高效液相指纹图谱的整体定性鉴别及含量测定等。本研究建立了赛北紫堇的薄层鉴别、高效液相指纹图谱及该药材中主要有效成分原阿片碱含量的分析方法，并对该药材水分、灰分和浸出物进行测定，为民族药的开发与利用提供基础。

1 仪器与材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪、二极管阵列检测器（美国Agilent）;AT 201型1/10万以及XP6型1/100万电子天平（瑞士梅特勒公司）;硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）等。原阿片碱对照品（批号：110853201404，中国食品藥品检定研究院）;比枯枯灵对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-1720202）;甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA），其余试剂均为分析纯，水为超纯水。赛北紫堇由青海省海南州藏医院提供，经江苏省中医药研究院黄一平研究员鉴定为罂粟科紫堇属植物赛北紫堇Corydalis impatiens（Pall.）Fisch.的干燥全草。药材来源见表1。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

称取赛北紫堇药材粉末4 g，加二氯甲烷-甲醇-浓氨试液（5∶1∶0.1）混合溶液40 mL，超声处理30 min，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液[10-13];取原阿片碱对照品，加甲醇制成每1 mL含有1 mg的溶液，作为对照品溶液;吸取供试品及对照品溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3）为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，喷以改良碘化铋钾试液，在日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1。

2.2 检查与浸出物

参照2015版《中国药典》（四部）通则水分测定法、灰分测定法、浸出物测定法对样品进行测定，结果见表2。

由表2结果结合实际应用，初步拟定本品水分不得过14.0%，总灰分不得过13.0%，酸不溶性灰分不得过1.0%，醇浸出物含量不少于16.0%。

2.3 HPLC测定原阿片碱的含量

2.3.1 色谱条件与系统适应性试验色谱柱：X-Bridge TM C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（取三乙胺5 mL，冰醋酸2 mL，加水稀释至1000 mL）（20∶80）等度洗脱[14-18]，流速1.0 mL/min，检测波长289 nm，柱温25℃，进样量5 μL。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液进样测定，理论板数按原阿片碱峰计算不低于3000（图2）。

2.3.2 对照品溶液制备精密称取原阿片碱对照品适量，加甲醇制成浓度为0.585 mg/mL的原阿片碱对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备取赛北紫堇药材粉末1.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，用甲醇补足失重，滤过，取滤液，过膜，即得。

2.3.4 方法学考察以原阿片碱质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得到回归方程：Y = 6.211X - 38.628（r = 0.9999）。表明原阿片碱在质量浓度范围11.71～585.80 μg/mL内呈良好的线性关系。精密度试验中，连续进样6次，测得原阿片碱峰面积RSD为1.16%，表明仪器精密度良好。重复性实验中，样品中原阿片碱平均含量为0.12%，RSD为2.75%，表明方法重复性良好。稳定性试验中，24 h内原阿片碱的RSD为1.80%，表明供试品在24 h内稳定。加样回收率试验中，根据峰面积计算加样回收率，结果见表3。

2.3.5 样品的含量测定取赛北紫堇药材10批，按“2.3.3”项下供试品方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，测定样品中原阿片碱含量，结果见表2。由表2可知，10批赛北紫堇药材中原阿片碱含量在0.110%～0.138%之间。

2.4 HPLC-DAD指纹图谱研究

2.4.1 色谱条件 X-Bridge TM C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-三乙胺醋酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A;20～30 min，15%～18%A;60 min，22%A）[19-22];流速1.0 mL/min;检测波长289 nm;柱温25℃;进样量10 μL。

2.4.2 对照品溶液制备精密称取原阿片碱对照品适量，加甲醇制成浓度为0.1 mg/mL的原阿片碱对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液制备取本品粉末约1.0 g，精密加入甲醇40 mL，称重，加热回流1 h，放冷，用甲醇补足失重，过膜，即得。

2.4.4 方法学考察供试品溶液按“2.4.1”色谱条件连续进样6次，各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均<1%，表明仪器精密度良好。6份样品中各色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD均<3%，表明重复性良好。供试品溶液24 h内相对保留时间和相对峰面积RSD均<2%，表明供试品在24 h内稳定。

2.4.5 赛北紫堇共有模式的建立及相似度评价将10批赛北紫堇药材制备成供试品溶液，进样测定，记录色谱图。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件处理，进行色谱峰匹配，确定14个共有色谱峰，建立对照图谱（图3）和药材指纹图谱（图4），其中10号峰为原阿片碱，13号峰为比枯枯灵。根据指纹图谱相似度评价结果，10批赛北紫堇样品与生成的对照图谱的相似度分别为0.946、0.990、0.957、0.986、0.933、0.952、0.953、0.995、0.986、0.960。10批样品相似度均>0.90，且与对照指纹图谱具有较好的一致性，表明大部分药材样品间差异较小，质量稳定性良好。

3 讨论

3.1 TLC鉴别

TLC鉴别实验前期比较了提取溶剂和提取方式，确定了最佳提取条件，并对展开体系、显色剂种类进行考察，确定了以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3）具有较好的分离性能，Rf值适中。

3.2 HPLC测定原阿片碱含量及指纹图谱建立

考察了不同溶剂对原阿片碱提取效果，发现甲醇提取出的原阿片碱含量最高，峰形较好;同时比较了超声、回流提取方式以及不同提取时间，确定采用甲醇加热回流1 h的提取方式。考察多种流动相体系，最终发现乙腈-三乙胺醋酸水溶液系统，峰形最佳，分离情况良好。多次调整乙腈-三乙胺醋酸水溶液比例，最终得到最优的流动相洗脱条件。

藏药是中华民族医药的瑰宝，由于地域特点和独特的地理资源，形成了具有民族特色的医药理论体系，在临床应用中效果显著。民族药来源广泛，因此对药材质量控制和评价进行研究是十分重要的。药效是多种成分协同作用的结果，单一的成分测定不足以评价其质量，本研究通过建立薄层色谱和指纹图谱及其含量测定方法，较全面地反应赛北紫堇的质量。通过对10批赛北紫堇甲醇提取物进行HPLC指纹图谱测定，确定了14个共有峰，并确认10号峰为原阿片碱，13号峰为比枯枯灵，并对其水分、灰分和浸出物进行测定，进一步完善藏药赛北紫堇质量标准，为藏药进一步开发和利用提供依据。

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