烟草糖酯的分析与合成研究进展

2019-10-10罗昭标

农产品加工 2019年18期

陈欢，罗昭标

（1.南昌工学院，江西南昌 330108；2.江西省烟草公司抚州市公司，江西抚州 344000）

糖酯是主要的烟叶表面化合物，广泛存在于许多茄科植物的腺茸毛分泌物中，它们或以蔗糖酯（Sucrose Esters，SE）、葡萄糖酯（Glucose Esters，GE）或其混合物的形式出现。不同类型烟叶中糖酯的含量有所差异，在香料烟中的含量最高，在烤烟中含量居中，而在马里兰烟和白肋烟中的含量最低。糖酯类物质是烟用香精香料的重要组成成分之一，而且是许多挥发性香气成分的前体物。糖酯也是一种表面活性剂，其在烟叶表面容易形成一层油水相隔的保护膜，具有保香、保湿和保润功效。糖酯还可用作生物杀虫剂，对人和恒温动物无毒，同时具有抗微生物和调节植物生长作用[1]。

近年来，糖酯的功能与应用日益受到关注，综述了烟草中糖酯的分类结构、提取分离、检测分析和合成方法等方面的研究进展，并提出糖酯在这些方面的研究重点方向，旨在为糖酯研究提供参考。

1 烟草糖酯的分类

葡萄糖酯中，根据乙酰基的个数及取代位置不同，Shinozaki Y等人[2]把烟草中的葡萄糖酯分为3类。

葡萄糖酯的分类见图1。

图1 葡萄糖酯的分类

第1种类型的葡萄糖酯，有2个羟基被乙酰化，分别在C1和C6位，C2，C3，C4位上的羟基被短链脂肪酸酯化。第2种类型的葡萄糖酯只有C6位上羟基被乙酰化，C1位置上羟基处于游离状态，C2，C3，C4位上羟基被短链脂肪酸酯化。第3种类型的葡萄糖酯中没有乙酰基，C1和C6位上羟基都处于游离状态，C2，C3，C4位上羟基被短链脂肪酸酯化。

蔗糖酯中，根据乙酰基是取代果糖环上的羟基还是葡萄糖环上的羟基，Severson R F等人[3]将烟草中的蔗糖酯分为了3类。

蔗糖酯的结构I-III见图2。

图2 蔗糖酯的结构I-III

普通烟草中的糖酯都属于第1种类型，葡萄糖环上C6上羟基被乙酰化，C2，C3，C4的羟基被短链脂肪酸酯化，果糖环上的羟基全部处于游离状态。Severson R F等人[4]从香料烟表面蜡质层分离出一系列这种类型糖酯，并用气相色谱与质谱联用技术将其分为6组，它们有着共同的结构特点：都是蔗糖四酯，葡萄糖环上C6被乙酰化，果糖环上羟基全部游离，C2，C3，C4的羟基被短链脂肪酸酰化，短链脂肪酸的碳链长度均为2-8。第2种类型和第3种类型的糖酯均存在于黏毛烟草中。

2 烟草糖酯的分析

2.1 烟草糖酯的提取方法

从新鲜烟叶提取糖酯，主要采用浸提法[5]，要求浸提时间尽量短，以防烟叶内部化学成分被浸出，通常每片叶片浸提3次，每次2～3 s。从调制后的叶片中提取糖酯，常用超声波辅助萃取技术[6]，蔡莉莉等人[7]比较了超声振荡法和机械振荡法对烟草中蔗糖酯提取效率的影响，结果表明，超声振荡法更适合用于烟草中蔗糖酯的提取。超声波辅助萃取技术具有高效、节时、溶剂用量少、萃取完全、工艺简单等优点，已广泛用于烟草中各种有效成分的提取中。

提取溶剂的选择是保证提取效率的关键。根据“相似相溶”原则选择，主要为二氯甲烷[7]、三氯甲烷、乙腈[8]等。由于烟叶内部物质复杂，每类溶剂都存在一定的局限性。二氯甲烷会同时提取出烟叶表面的碳烃化合物，此类物质会对蔗糖酯的分离产生干扰，选用乙腈为提取溶剂，可避免上述问题[9]。三氯甲烷作提取溶剂，需加入乙醇作保护剂，而乙醇会分解衍生化试剂且很难被除去[10]。正己烷等烃类溶剂对极性的蔗糖酯类物质的溶解性比较差，甲醇和丙酮等能与水互溶的挥发性溶剂会使烟叶脱水，且非极性的糖酯类物质在其中的溶解性不好[11]。

2.2 烟草糖酯的纯化方法

糖酯的纯化方法主要有硅胶柱色谱法和液相色谱法2种。

2.2.1 硅胶柱色谱法

糖酯中含有羟基，有一定极性，硅胶中也有羟基，它们之间有着氢键作用。糖酯和洗脱剂与硅胶之间靠吸附-解析-吸附达到分离，影响分离的主要因素为糖酯与硅胶间的氢键作用力和样品与洗脱剂间的作用力。因此，选择合适的洗脱溶剂是有效分离的关键。一种单一溶剂往往难以达到好的分离效果，常选用混合溶剂以达到合适的溶剂强度。

硅胶柱层析是运用最多的方法，适用于中等分子量的化合物的分离，尤其是脂溶性的成分，层析效果由被分离化合物的性质、吸附剂和洗脱剂这3个因素决定。Severson R F等人[4]将液-液分离后的提取物Sephadex LH-20型凝胶层析柱，用氯仿淋洗，最后分离得到6种蔗糖酯，它们的主要不同是葡萄糖环上所连的脂肪酸不同。Shinozaki Y等人[2]将烟叶的三氯甲烷萃取物用硅胶柱最后得到4种蔗糖酯。Danehower D[11]用硅胶固相萃取柱分离烟叶的CH2CL2萃取物，气相（GC）结果表明烟叶表面总物质的50%可以用这种方法洗掉，而99%的蔗糖酯保留在SPE柱上。Kandra O L等人[9]用乙腈作为提取溶剂从烟叶表面提取蔗糖酯类物质，用HPLC法氰基柱进行分离，共得到4种组分，最后一部分是蔗糖酯。

2.2.2 液相色谱法

液相色谱法就是用液体作为流动相，基于混合物中各组分对两相亲和力的差别进行分离的色谱法，根据吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。

Kandra O L等人[9]将萃取液用氮气吹干，残余物用10 mL水溶解和20 mL氯仿，分层后弃去水相，氯仿相用无水Na2SO4干燥和氮气吹干后，再次溶解在10 mL氯仿中，用高效液相色谱法分离，得到4种馏分，最后一种馏分是蔗糖酯。Toshiake M等人[12]利用高效液相色谱法从不同品种烟叶表面提取物中分离得到了不同类型的蔗糖酯。Severson R F等人[13]用反相C18高效液相色谱柱，以乙腈∶水（V∶V）=1∶1为流动相，示差折光检测器检测，得到了糖酯类组分。

2.3 烟草糖酯的检测分析

目前，糖酯结构的鉴定主要采用核磁共振（NMR）、红外（IR）及质谱（MS）等方法，定性和定量则采用薄层色谱（TLC）法、液相色谱（HPLC）法或液相色谱与质谱联用（HPLC/MS）、气相色谱（GC）或气相色谱与质谱连用（GC/MS）法。

2.3.1 TLC法

TLC法是从柱色谱发展而来的，其固定相采用的吸附剂比传统柱色谱更细更均匀，具有较高的灵敏度。阳会兵等人[14]选取7个烤烟品种作为试验对象，硅胶板作固定相，选用合适的展开剂和显色剂，分离和分析了烟叶中的蔗糖酯含量。

2.3.2 GC或GC/MS法

糖酯的分子量较大且挥发性差，所以无法直接进行GC/MS分析，通常需要进行衍生化。衍生试剂一般选用N,O-双-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺，衍生时，需二甲基甲酰胺（DMF）作催化剂，水浴加热，弱极性色谱柱。但是DMF具有较大的极性，会引起较严重的柱流失。且气相色谱的检测器为EI质谱时，硅烷化糖酯的分子离子峰不会出现。Einolf等人[15]采用直接化学离子化质谱（DCI/MS）法测定了烟草中蔗糖酯的含量。该方法中未对蔗糖酯进行衍生，而是使氨气与蔗糖酯反应，这是因为反应产物的灵敏度和选择性较高。

2.3.3 LC或LC/MS法

随着LC/MS越来越多地被运用，越来越多的烟草化学研究者也开始探索该技术用于烟草中蔗糖酯的研究[16]，尤其是蔗糖酯葡萄糖环和果糖环上酰基取代类型的研究。Khorassani M A等人[17]用LC-MS法定性分析蔗糖酯时发现，蔗糖酯的酰基取代基的碳骨架中存在着不饱和键。

LC法可以直接对样品进行分析，不需对样品进行衍生化，但是由于糖酯类的紫外吸收很弱，液相色谱法中常规检测器紫外检测器无法满足分析的要求，示差折光检测器虽然可以用于分析，但其灵敏度较低，且不能进行梯度洗脱，所以目前运用LC法对烟叶中糖酯尤其是葡萄糖酯的分析很少见。

3 烟草糖酯的合成

3.1 烟草体内生物合成

烟草中的葡萄糖酯和蔗糖酯是在烟草茸毛腺细胞中合成的，是腺细胞的分泌物，这种分泌物连同烟草表皮和亚表皮分泌物一起在烟草的表面积累[18]，烟草和其他植物腺细胞合成蔗糖酯的主要原料是支链氨基酸和蔗糖新陈代谢产生的活化酸[19-20]。腺毛细胞有可能是进行生物合成的唯一场所，同样的长链腺毛类型可以产生主要的流出成分，研究发现分离的腺毛细胞可以在有灯光的情况下从CO2合成蔗糖酯，这表明腺毛细胞可以进行光合作用，蔗糖和葡萄糖还可以通过碳酸氢盐合成蔗糖酯的蔗糖部分，因此，蔗糖酯的蔗糖或葡萄糖部分是由转移到腺体中的多糖经过蔗糖酶转化为蔗糖的[9]。蔗糖酯的酰基部分可能是直链的也可能是支链的（异构的或反异构的），它们可能是通过2种途径合成的：①脂肪酸合成酶或加长酶代谢；②α-酮酸加长途径（α-KAE）。Kandra A B和Netab B[21-22]等人发现，烟草中蔗糖酯的酰基部分是通过α-KAE即支链氨基酸代谢的一种改进形式衍生的，该途径中酰基主要是由α-KAE衍生的2-甲基丁酰基辅酶A(CoA)经过2-甲基支链CoA脱氢酶的转化生成。引起烟草蔗糖酯酰基链型差异（异构或反异构、支链和直链）的原因尚不明确，可能是α-KAE的一种关键酶的底物专一性造成的[23]，可能是因为α-KAE中某些链的终止机制可导致酰基链长的差异，但这种推测还没有被证实。目前，蔗糖酯合成中的酶及其调控基因还未得到分离和鉴定出，也未了解某些蔗糖酯中的乙酰基在果糖环上（C2，C3）和酰基在葡萄糖环上（C2，C3，C4）取代专一性的原因。

Kandra O L等人[9]研究了烟草腺毛中糖酯的形成及代谢过程。研究过程中将烟草腺毛细胞与表皮和亚表皮细胞分离开，2种细胞一起分别用CO2加乙酸酯培养，对代谢产物进行测定，结果发现只有带腺毛细胞的体系能产生蔗糖酯。Einolf W N等人[24]对不同类型的烟草生长过程中的蔗糖酯含量进行测定。结果显示，香料烟生长过程中蔗糖酯的累积量最高，其次是白肋烟，烤烟的积累量最少；并且随着烟草的生长，其含量呈现出先增高后降低然后再增高的趋势，并且含量在完熟时达到最高。

3.2 烟草体外化学合成

烟草中糖酯的结构比较特殊，用化学法合成，难度较大，目前国内外有关糖酯的合成的报道较少。最早合成出的糖酯是一种葡萄糖酯，即6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-（3-甲基戊酰基）-β-D-吡喃葡萄糖，对这种物质的鉴定是采用与从烟草中分离纯化出的这种糖酯的结构进行比对，从而确定其结构。葡萄糖四元酯的合成以6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-异丁酰基-β-D-吡喃葡萄糖酯为例，其合成方法为以β-D-甲基吡喃葡萄糖苷为起始原料通过羟基保护和去保护法选择性地合成目标产物。

烟草中蔗糖四元酯的合成过程需要先合成得到中间体6-O-乙酰基-3-O-烯丙基-1',3',4',6'-四-O-苄基-2-O-(4-甲氧基苄基)蔗糖。该中间体中的1',3',4',6'的羟基都连有苄基，从而起到保护这些位置羟基的作用，2,4位羟基通过酯化作用变成酰基，3位的烯丙基可以通过异构化和水解作用使其变成酰基。通过这一中间体合成的糖酯结构与烟草中所含糖酯的结构相同。Garegg R J等人[25]以蔗糖为原料，成功合成出6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-3-甲基戊酰基]蔗糖。Oscarson S等人[26]研究得到6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-2-甲基丁酰基]蔗糖和6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-2-甲基丁酰基]-二-O-[(S)-3-甲基戊酰基]蔗糖的3种同分异构体的合成方法。