响应面分析结冷胶发酵培养基优化研究

周龙海

（华东理工大学生物工程学院，上海 200237）

结冷胶是用微生物发酵方法生产的胞外多糖胶质胶凝剂，具有增稠、悬浮、乳化、稳定等优点，是性能优越的食品胶之一，广泛应用于制药、食品、化妆品和化工等行业中。而发酵培养基是结冷胶生产的重要前提，结冷胶培养基的主要成分包括碳源、氮源、无机盐和其他营养物质[1-2]。其中，碳源可使用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉等，氮源可使用蛋白胨、玉米粉、大豆油胨、酵母粉、硝酸铵等，无机盐包括磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钾，其他营养物质为表面活性剂吐温等。研究表明，筛选出的不同菌株对最佳的碳源、氮源均不同，杨冬月，吴军林等人[3-4]研究发现结冷胶培养基的最佳碳源是蔗糖，而胡桂萍等人[5]发现结冷胶培养基最佳碳源为葡萄糖，牛永利等人[6]发现最佳碳源为可行性淀粉，李海军等人[2]发现结冷胶培养基最佳氮源为大豆油胨，而文春溪等人[7]发现最佳氮源为酵母粉。试验筛选出1株产量较高的菌株，为了更好地提高其生产强度，以结冷胶发酵液的黏度和产胶率为指标，通过单因素试验选择最佳的碳源、氮源和无机盐，并确定添加量，选择合适的水平和因素；通过响应面优化试验，确定培养基的最佳添加量，建立发酵培养基模型，并对模型进行验证，最后得到最佳培养基成分，对结冷胶的工业化生产具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株为实验室保藏菌株，编号为Sphingomonas paucimobilis NK2000。

1.2 材料

培养基中碳源、氮源和无机盐均为市售产品，分析纯。

1.3 测定方法

（1）表观黏度。发酵液直接测定，采用NDJ21型，转子黏度计，温度28℃，3号转子，转速60 r/min。

（2）粗多糖转化率及粗多糖含量测定。20～50 g发酵液加1倍体积95%乙醇沉淀产物，收集沉淀，加同体积95%乙醇洗涤沉淀2次，再收集沉淀，于70℃条件下烘干2 h，称质量（粗多糖质量），再按下式计算：

1.4 试验方法

1.4.1 碳源的选择

选择最有可能是最佳碳源的试验用糖（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖）按3%的添加量，氮源和无机盐不变进行发酵培养，得出最后发酵液的黏度和产胶率，每个试验做3个平行样。

1.4.2 碳源添加量的优化

选择葡萄糖作为碳源，添加量分别设定为2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，其他成分不变，进行单因素试验，60 h后测得发酵液黏度和产胶率。

1.4.3 氮源的选择

选择最有可能是最佳氮源的试验用氮（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、硝酸铵）按0.5%的添加量，碳源和无机盐不变，进行发酵培养，得出最后发酵液的黏度和产胶率，每个试验做3个平行样。

1.4.4 氮源添加量的优化

选择酵母粉作为氮源，添加量分别设定为0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，其他成分不变，进行单因素试验，60 h后测得发酵液黏度和产胶率。

1.4.5 无机盐的选择

选择最有可能是最佳无机盐（硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、氯化锰和硫酸亚铁）按0.1%添加量，碳源和氮源不变，进行发酵培养，得出最后发酵液的黏度和产胶率，每个试验做3个平行样。

1.4.6 无机盐添加量的优化

选择1.4.5产胶率最高的作为无机盐，添加量分别设定为0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%，0.14%，0.16%，其他成分不变，进行单因素试验，60 h后测得发酵液黏度和产胶率。

1.4.7 响应面优化试验

采用响应面中心组合设计（Box-Behnken Design，BBD），对影响结冷胶发酵后产胶率的显著影响因子（碳源、氮源、无机盐）进一步优化，结合因素的效应大小和试验中的实际情况，选择试验水平的中心点，响应值为产胶率[8]。

BBD试验设计因素及代码水平见表1。

表1 BBD试验设计因素及代码水平

2 结果与分析

2.1 碳源对发酵的影响

不同碳源对发酵的影响见图1。

图1 不同碳源对发酵的影响

由图1可知，当葡萄糖作为碳源时，结冷胶的黏度和产胶率都最高，分别为4 600 cp和1.79%，蔗糖和麦芽糖其次，可溶性淀粉最低，因此将选择葡萄糖作为最佳碳源。

选择葡萄糖为碳源，以添加量为变量，设置1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%共6个梯度值，其他成分不变，进行发酵试验。

葡萄糖添加量对发酵的影响见图2。

图2 葡萄糖添加量对发酵的影响

由图2可知，结冷胶的产胶率和黏度随着葡萄糖量的增加而增加，当葡萄糖添加量为3%时，结冷胶的黏度和产胶率达到最高，分别为4 800 cp和1.81%，之后随着葡萄糖添加量增加，结冷胶的产胶率和黏度逐渐减少，这是因为葡萄糖比例过大，导致菌种生产迅速，反而抑制了次级代谢产物的生成。因此，最终确定最佳的葡萄糖添加量为3%。

2.2 氮源对发酵的影响

不同氮源对发酵的影响见图3。

图3 不同氮源对发酵的影响

由图3可知，当蛋白胨作为氮源时，结冷胶的黏度和产胶率都最高，分别为4 700 cp和1.75%，酵母粉其次，硝酸铵最低，因此将选择蛋白胨作为最佳氮源。

选择蛋白胨为氮源，以添加量为变量，设置0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%共5个梯度值，其他成分不变，进行发酵试验。

蛋白胨添加量对发酵的影响见图4。

图4 蛋白胨添加量对发酵的影响

由图4可知，结冷胶的产胶率和黏度随着蛋白胨添加量的增加而增加，当蛋白胨添加量为0.6%时，结冷胶的黏度和产胶率达到最高，分别为4 800 cp和1.72%，之后随着蛋白胨添加量增加，结冷胶的产胶率和黏度逐渐减少，这是因为蛋白胨添加比例过大，导致菌种生产迅速，反而抑制了次级代谢产物的生成。因此，最终确定最佳的蛋白胨添加量为0.6%。

2.3 无机盐对发酵的影响

不同无机盐对发酵的影响见图5。

由图5可知，当无机盐为硫酸镁或者磷酸二氢钾时结冷胶的产胶率和黏度都相对较高，产胶率分别达到1.76%和1.75%，黏度分别达到4 750 cp和4 700 cp。然后分别选择硫酸镁和磷酸二氢钾作为无机盐，以添加量为变量，其他成分不变，得到2条结冷胶产胶率曲线。

图5 不同无机盐对发酵的影响

无机盐添加量对发酵的影响见图6。

图6 无机盐添加量对发酵的影响

由图6可知，硫酸镁和磷酸二氢钾的最佳添加量分别为0.06%和0.14%，产胶率分别为1.74%和1.76%。

2.4 响应面优化试验结果

根据Box-Behnken试验设计原理，选取X1，X2，X3，X4进行四因素三水平的响应面分析方法，以产胶率为响应值。

BBD试验设计与结果见表2。

采用Design Expert 10软件对试验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联式，得到回归方程式：

回归模型方差分析见表3。

由表3可知，模型Pr＞F=0.000 1，说明响应面回归模型达到了极显著水平，模型的校正系数R=0.984 3，表明该方程拟合程度良好。模型的修正系数R2Adj=0.932 2，表明该模型较好地反映了各因素之间的关系。通过对回归方程的方差分析得出，一次项X1，X2，X3，X4；二 次 项X12，X22，X32，X42和 交 互 项X1X2，X1X4，X2X4对产胶率的影响是显著的，各试验因子对产胶率的影响为非线性关系。

试验因子交互作用对产胶率的影响见图7。

由图7可知，两因素之间的影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点，变化趋势为先增大后减小。通过求解回归方程得到结冷胶培养基的最佳工艺是葡萄糖添加量3.235%，蛋白胨添加量0.5246%，硫酸镁添加量0.06374%，磷酸二氢钾添加量0.1463%，产胶率的预测值是1.781 3%。考虑到实际操作，将试验的条件修改为葡萄糖添加量3.2%，蛋白胨添加量0.52%，硫酸镁添加量0.064%，磷酸二氢钾添加量0.15%。

表2 BBD试验设计与结果

表3 回归模型方差分析

图7 试验因子交互作用对产胶率的影响

在最佳组合条件下重复试验3次，测定实际产胶率含量为1.74%，与预测值1.78%基本吻合，偏差较小，说明得到的回归模型和实际情况拟合较好，进一步验证了该模型的可行性。

3 结论

首先，通过对结冷胶培养基中碳源、氮源和无机盐进行单因素优化，最终确定最佳碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨、无机盐为硫酸镁和磷酸氢二钾。其次，通过采用响应面Box-Behnken Design中心组合设计优化试验，确定了以葡萄糖添加量3.2%，蛋白胨添加量0.52%，硫酸镁添加量0.064%，磷酸二氢钾添加量0.15%的最优培养基成分，并建立了结冷胶发酵培养基模型。最后，对模型进行了验证，获得产胶率为1.74%，说明模型能较好地预测产胶率的实际情况，具有较好的生产指导意义。