高效液相色谱法测定染发剂中对苯二胺等32种染料组分

倪 琳,欧阳晓玫,李若绮,武 悦,徐勤科,杜 兴

(甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 73000)

染发类化妆品具有改变头发颜色的作用[1]. 染发剂依据染发效果可分为三类：暂时性、半持久性和持久性. 其中以氧化型染发剂最为流行，属于永久性染发剂，染料中间体主要成分多为苯胺类化合物，使用后可能引起不良反应[2]. 2017年国家化妆品不良反应监测系统中共收到染发类化妆品不良反应/事件报告2 688份，占收集到全部特殊类化妆品不良反应报告的21.02%. 染发类化妆品不良反应主要表现为皮损红斑、丘疹等症状，使用者自觉症状以瘙痒为主，其次为灼热感、疼痛、紧绷感、干燥、头晕、头痛等. 频繁使用染发产品可能带来的安全性问题一直受到广泛关注，染发产品也一直是化妆品管理和研究的重点之一[3-7]. 在我国染发类产品属于具有特殊用途的化妆品，为加强对染发剂使用安全和质量的管理,《化妆品安全技术规范》(2015 年版)中规定了化妆品的 75 种准用染发剂和在使用时的最大允许浓度, 并将邻苯二胺、邻氨基苯酚、对苯二胺、 2-硝基对苯二胺、甲苯-3,4-二胺、间苯二胺、氢醌、N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐等多种染料组分列为禁用组分. 目前，对染料组分的测定主要采用高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法、毛细管电泳-间接化学发光法[8-13]. 其中高效液相色谱法因仪器普及率较高、灵敏度高以及分析速度快等特点而被广泛应用于染发剂染料组分的分析测定. 同时, 规范中也推荐了适用于染发类化妆品中对苯二胺等 8 种氧化型组分的含量测定方法和适用于染发类化妆品中对苯二胺等 32 种组分含量的测定方法[14-15]. 但在实际工作中发现,按照规范中检测32种染料组分的方法测定，有3个组分未达到基线分离. 并且由于染发剂的基质较复杂，按照规范方法制备的供试品溶液无法过滤. 本研究优化了《化妆品安全技术规范》(2015年版)中高效液相色谱法测定染发剂中对苯二胺等 32 种组分含量的方法,随机抽取了50 批市售染发剂进行检测, 并根据检验结果对染料组分的种类、用量等使用情况进行统计分析.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Alliancee2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME204电子天平(瑞士梅特勒公司)；XS205DU电子天平(瑞士梅特勒公司).

随机抽取甘肃地区27个市、州、县地区专卖店、商场、超市、美容美发场所、集散市场等出售的染发剂共计50批次.

32种染发剂标准品的信息如表1所列.

1.2 标准溶液的制备

取各染料标准品0.1 g，精密称定，加入2 g/L亚硫酸氢钠水溶液-无水乙醇(体积比为1:1)的混合溶液，制成质量浓度为10 g/L的各染料标准储备溶液. 分别用2 g/L亚硫酸氢钠水溶液溶解甲苯-2,5-二胺硫酸盐和2-氯对苯二胺硫酸盐并定容，甲苯-3,4-二胺使用无水乙醇定容. 精密称定2-硝基对苯二胺和4-硝基邻苯二胺25 mg，使用无水乙醇定容，配成质量浓度为2.5 g/L的溶液. 2,4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、对甲基氨基苯酚硫酸盐、2,6-二氨基吡啶、N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐使用流动相(磷酸盐混合溶液) 溶解. 2～4 ℃保存，2天内使用.

1.3 标准曲线的绘制

对32种标准品依照组分进行分组，并根据分组情况，分别精密量取标准储备溶液适量于10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，配成质量浓度为500 mg/L的混合标准溶液. 取混合标准溶液适量，用无水乙醇稀释，配制成浓度分别为50、100、250、500、600、700、800 mg/L的混合标准系列溶液，标准系列溶液应于使用前配制. 取各标准系列溶液5 μL注入高效液相色谱仪，分别采用3种流动相进行分析，记录各色谱峰面积，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线.

1.4 供试品溶液的制备

取样品0.5 g，准确称量至0.000 1 g，置25 mL具塞比色管中，加入无水乙醇-水(体积比为1∶1)的混合溶液至刻度，涡旋1 min，冰浴超声提取15 min，低温离心(5 000 r/min)5 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液.

1.5 色谱条件[16]

第一组：仪器型号：Waters Alliancee2695高效液相色谱仪；二极管阵列检测器；色谱柱：SUPELCO Solutions within C16(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温:25 ℃,流动相：乙腈-磷酸盐混合溶液(称取十二水合磷酸氢二钠1.8 g，磷酸二氢钾2.8 g和庚烷磺酸钠1.0 g，用水稀释至1 L，用磷酸调pH至6，体积比为10∶90)；检测波长：280 nm；运行时间：35 min,进样量：标准品5 μL，样品10 μL，流速：1.0 mL/min.

第二组：仪器型号、色谱柱、柱温、检测波长、进样体积及流速同第一组. 流动相：甲醇-磷酸盐混合溶液(配制方法同第一组，体积比为10∶90)；运行时间：40 min.

第三组：仪器型号：LC-20A高效液相色谱仪；二极管阵列检测器；色谱柱、柱温、检测波长、进样体积及流速同第一组；流动相：乙腈-磷酸盐混合溶液(配制方法同第一组，体积比为40∶60)；运行时间：35 min.

表1 32种染发剂标准品信息Table 1 Information of 32 reference substances in dye

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

取同一批号样品，按照供试品及混合标准品溶液的方法制备，使用 CAPCELLPAK C18色谱柱、Diamonsil C18色谱柱、Phenomenex C18色谱柱和SUPELCO Solutions within C164 个不同品牌色谱柱进行测定,试验结果表明SUPELCO Solutions within C16色谱柱能实现所有染料的基线分离,且重现性较好，故选用该色谱柱.

2.2 流动相的选择

因流动相中加入离子对试剂，对色谱柱的使用寿命影响较大，故试验了流动相中不加离子对试剂(庚烷磺酸钠)，结果样品和混合标准品中部分染料组分在色谱柱上无保留，因此，流动相中需要加离子对试剂.

2.3 染发剂中32种染料组分分组情况

分组依据：将同分异构体、结构相似的组分重新分组，不易分离的物质分到不同组中进行检测. 试验中发现《化妆品安全技术规范》(2015年版)方法中第一组的间苯二酚、苯基甲基吡唑啉酮、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺盐酸盐未达到基线分离，将上述三种组分分到第三组，分离效果较好(如表2所列、图1～3所示).

表2 32种染料组分分组情况Table 2 Distribution of 32 constituents in dye

图1 第一组混合标准品高效液相色谱图Fig. 1 HPLC of group Ⅰof mixed standard products

图2 第二组混合标准品高效液相色谱图Fig. 2 HPLC of group Ⅱ of mixed standard products

图3 第三组混合标准品高效液相色谱图Fig. 3 HPLC of group Ⅲ of mixed standard products

2.4 线性关系、检出限和定量限

线性范围、相关系数(R2)、检出限和定量限结果如表3所列. 由表3可知，在相应的浓度范围内，各染料组分峰面积和对应的浓度具有良好的线性关系，R2均高于0.99. 对标准溶液进行逐级稀释，以S/N=3确定检出限(LOD)，以S/N=10确定定量限[LOQ,参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)]中染发剂的使用限度，该方法的检出限低于规范规定的限度，满足实际样品的分析要求.

2.5 精密度和准确度试验

对高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液进行平行测定6次，计算32种染料组分峰面积的RSD，均小于4%. 故精密度满足分析要求.

由于染发剂空白样品较难得到，故制备不含氧化型染料的空白样品，均加入高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液进行加标回收，每个浓度水平重复测定2次，结果各染料组分低浓度水平的加标回收率为74%～114%，中浓度水平的加标回收率为79%～110%，高浓度水平的加标回收率为83%～104%.

2.6 稳定性试验

将高、中、低3个浓度水平的混合标准溶液置于室温下，每个浓度水平的标准溶液于0,2,4,6,8,10 h各测定1次，计算各组分峰面积的RSD均小于3%，结果32种染料组分在10 h内稳定.

2.7 染发剂中32种染料组分的含量测定结果

对50批染发剂中32种组分的含量进行测定，其中有2批次检出禁用组分邻氨基苯酚,有1批次的苯基甲基吡唑啉酮超出规定的限量. 对50批次染发剂中32种组分的检测中检出的各组分进行统计，结果表明：染发剂使用染料组分频率最高的是对苯二胺、间苯二酚、间氨基苯酚和对氨基苯酚，其次是2,4-二氨基苯氧基乙醇盐酸盐、甲苯-2,5-二胺硫酸盐、苯基甲基吡唑啉酮、2-甲基间苯二酚、4-氨基-2-羟基甲苯、2-氨基-3-羟基吡啶、4-氨基间甲酚、6-羟基吲哚、N,N-双(2-羟乙基) 对苯二胺硫酸盐、1-萘酚和4-氯间苯二酚等.

表3 32种染料组分的回归方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 3 Regression equations,linearity ranges,correlation coefficients,detetion limits and limits of quantification of 32 dye components

2.8 染发剂质量评价[17]

50批次染发剂中有25批次不合格，其中，未超过规定限量但存在问题的样品有22批次，其使用频率较高的间氨基苯酚不合格率高达42%，对苯二胺不合格率高达26%. 50批染发剂中有12批次产品标签标识与批件配方信息虽然一致，但存在以下问题：(1)检出批件及标签未标识的染发剂.(2)未检出批件及标签标识的染发剂.(3)同时存在检出和未检出的情况.此类产品虽然未超过规定限量，依然视为有问题的样品，即不合格. 还有13批次产品标签标识与批件配方信息不一致，存在未检出批件标识的染发剂、未检出标签标识的染发剂、检出批件未标识的染发剂、检出标签未标识的染发剂以及同时存在检出和未检出等情况，即使未超规定限量，也为有问题的样品，即不合格.

2.9 染发剂采样地点情况分析

因甘肃没有染发剂生产厂家，生产环节没有采集到样品. 采样来自集散市场、商店、商场、药店、超市和美容美发场所. 除专卖店外，其他采样点均有不合格样品. 因采集到的样品有限，可能不具备代表性. 采集到的50批次样品，其中国产样品44批次，进口样品6批次. 经检验，进口样品全部合格，因抽样批数较少，只能做参考数据. 44批国产样品中25批不合格，合格率仅为43%，说明国产染发类化妆品质量有待进一步提高. 不合格样品中产地来自广东22批次，浙江2批次，上海1批次. 本次抽样中自广东的染发类产品共25批次，不合格样品占76%，需引起监管部门的重视.

3 结论

对《化妆品安全技术规范》(2015年版)染发类产品的检测方法进行改进，同时对50批染发类化妆品的检验结果进行分析，可以看出存在以下问题：(1)生产企业在产品包装上随意标识信息，误导欺骗消费者. (2)染发类化妆品不按照批件规定的配方生产，生产企业对《化妆品卫生规范》(2007年版)和《化妆品安全技术规范》(2015年版)规定允许使用的染料组分及禁用组分不明确.建议有关部门应规范染发类化妆品的包装标签标识，加强产品批件配方信息与包装标签识的一致性监管，进一步完善染发类化妆品的质量和规范销售市场.