茶叶中高氯酸盐检测方法研究进展

曾 艳，郞 红，邵 辉，王永佳，陈 亚

(雅安市农产品质量监测检验中心，四川 雅安 625000)

高氯酸盐是高氯酸形成的盐类，含有正四面体型的高氯酸根离子ClO4-，其中氯的氧化价为+7，极易溶于水，一旦进入环境介质即会随着地下水和地表水迅速扩散，从而造成污染的扩大化，是一种持久性、流动性极强的污染物[1-2]. 高氯酸盐由于具有与碘离子相似的电荷和离子半径，对碘离子的转运蛋白具有比碘更高的亲和力，因而能够抑制碘的吸收[3]，影响甲状腺素的合成，从而对骨骼、大脑、其他腺体和生殖器官造成影响，进一步影响人体正常机能. Jasper等[4]和York等[5]的试验证明,它对幼儿神经系统发育影响更加严重，分娩前，甲状腺激素影响宫内期脑细胞的增殖、分化和发育[6]. Bernhardt[7]和任新等[8]发现高氯酸盐对精子和胚胎有致畸、致死亡和变态发育的作用，导致动物生殖功能障碍. 高氯酸盐还可以使细胞发生结构上的改变，甚至可以作用于染色体干扰基因表达，促进癌变的发生[9]. 因此，高氯酸盐的污染引起了人们极大的关注. 美国环保局(EPA)分别3次将高氯酸盐列入污染物候选名单[10-11]，2002年，EPA建议饮用水中高氯酸盐的限量为1.0 μg/L. 2005年，给出健康饮用水终生临时指导值小于15 μg/L[12]. 2015年日本供水司规定地下水高氯酸盐含量不得高于5 μg/L[13].

以往对于高氯酸盐污染的研究和限量值多是从环境保护的角度出发，更多的是对饮用水作出了相关规定. 2015年4月29日，欧盟发布关于监测食物中高氯酸的第(EU)2015/682号委员会建议案[14]，建议成员国对水果、蔬菜及其加工产品、饮料、专供婴幼儿食用的特殊营养用途食品进行监测，发布了每日容许摄入量(tolerable daily intake，TDI)为0.000 3 mg/(Kg.d)[15]，因此，针对高氯酸盐的研究也渐渐从环境样品转变到食品上来. 根据2018年中国茶叶市场分析报告-行业深度分析与发展趋势预测[16]显示，目前国内对茶叶等农产品、加工食品中高氯酸盐的限定值尚无明确标准. 欧盟一直在拟定其残留限量，但直至目前，并没有正式出台食品中高氯酸盐的限量标准[17].

1 茶叶高氯酸盐研究现状

我国作为世界第一大产茶国，也是世界第二大茶叶出口国[18]，2016年初《新京报》报道，我国在出口欧盟的茶叶中检出了“新型污染物”高氯酸盐，更是引起了大家的广泛关注[19]. 这一新型污染物也成为茶叶出口的又一壁垒[20]. 由此，茶叶中高氯酸盐的检测研究在国内纷纷见报，而国外却鲜见报道. 2016年，孟维伟[21]、上海安谱实验室[22]和赛默飞公司[23]率先建立了茶叶中高氯酸盐的离子色谱(IC)检测方法. 刘小芳等[24]使用离子色谱-质谱法(IC-MS)检测茶叶中的高氯酸盐，而液相色谱-串联质谱技术(LC-MS-MS)由于假阳性少，定性定量准确在该类检测中发展迅速. 目前，国内外对于食品中高氯酸盐的限量值并没有标准，茶叶中高酸盐的限量更是没有定论，只考虑设定0.75 mg/Kg为其限量. 因此，本文总结了茶叶中测定高氯酸盐的各种方法，重点详述了液相色谱-串联质谱技术，以期为尽早制定茶叶中高氯酸盐的检测和限量标准提供基础，为茶叶质量的安全提供技术保障.

2 茶叶中高氯酸盐检测方法

2.1 离子色谱法(IC)

2.2 离子色谱-质谱联用法(IC-MS)

由于IC法检测茶叶中高氯酸盐存在非特异性、可产生假阳性、定量限太高等缺陷. 因此，刘小芳等[24]采用0.2%的乙酸水，超声振荡30 min提取，加入同位素内标，滤液直接上机检测的前处理方法，建立了IC-MS检测茶叶中高氯酸盐，使用IonPac AS 20阴离子交换柱分析，KOH溶液作淋洗液等度洗脱，负离子检测. 试验结果在0.02～10.0 μg/L范围内线性良好，定量限达到2 μg/Kg以下. 研究者使用该方法测定了市售5种茶叶样品，回收率良好. 该方法前处理操作简单，直接提取后检测，通过离子交换柱的分离和质谱对高氯酸盐固定质荷比的特异性检测，排除了其它物质的干扰. 相比单纯依靠柱子出峰时间来进行定性的IC检测法，质谱检测消除了其他离子对目标离子的干扰，检测准确度大大提高.

2.3 液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)

2.3.1 前处理方法

IC-MS法在柱子分离后，串联的抑制电导检测器可将部分干扰离子切出检测系统，减少干扰离子[25],因此前处理较为简单，但存在检测物质洗脱不完全的缺点. LC-MS-MS由于检测的灵敏度高、检出限低，已经广泛应用于地表水、污水、污泥等环境样品[26]和饮料、蔬菜、牛奶、奶粉[27-28]等食品样品中高氯酸盐的测定. 与环境样品如水样、食品样品如饮料等检测有很大不同，茶叶样品基质复杂，干扰物质多，直接进行检测会对仪器造成污染，同时也会对结果造成干扰. 因此，茶叶样品的前处理成为LC-MS-MS检测高氯酸盐中较为关键的部分，提取和净化直接决定了检测的准确度和精密度. 目前，茶叶样品主要的前处理方法如表1所列.

表1 茶叶中LC-MS-MS检测高氯酸盐前处理方法Table 1 Pretreatment of perchlorate in tea by LC-MS-MS

由表1可见，茶叶样品中的高氯酸盐提取剂主要有乙腈、水和不同浓度的乙酸水及甲醇水等. 其中，使用乙酸水作提取剂的研究较多. SN/T 4089-2015进出口标准[37]和美国FDA标准[38]中都以1%乙酸-水溶液对食品中高氯酸盐进行提取，比较了以上文献中不同浓度乙酸-水溶液对提取效果的影响发现，0.2%的乙酸水效果最佳，超声和振荡提取是茶叶中高氯酸盐检测常用的提取方式，提取时间多在25～30 min.

前处理中较为关键的步骤是去除大部分的干扰物质，而净化小柱的选择，决定了净化的效果. 由于C18对茶汤中大部分有机物质吸附能力较强，而Carbon对茶叶中的叶绿素、叶黄素、胡萝卜素、黄酮类物质等干扰物质保留作用明显，常作为茶叶中萃取除杂的吸附剂[39]，因此，在对茶叶样品中高氯酸盐净化时，大部分研究者使用了C18和Carbon 小柱，其平均回收率分别达到93%～105.3%和94.6%～120.0%. 也有部分研究者使用了HLB，但在价格成本上，C18和Carbon却更具优势，这也是该小柱在净化高氯酸盐时应用较少的原因之一.

除以上常用净化小柱外，也有研究者使用了新型的净化方式，如Yan Liu等[40]比较了多种净化小柱后发现，PWAX小柱的净化效果较好，在使用100 μg/mL甲酸水对PWAX进行预酸化处理后，其净化效果达到最佳. 但Yong-Gang Zhao等[41]却发现传统的SPE净化小柱针筒和微孔膜中检测到随机含有高氯酸盐. Yong-Gang Zhao等研究合成并使用了新型季铵盐改性磁羧基碳纳米管(qa-mag-ccnts)应用于茶叶中高氯酸盐的磁分散固相萃取(mag-dspe)预富集，试验结果表明，在最佳条件下，qa-mag-ccnts的提取率明显. 研究还表明，已经吸附过的qa-mag-ccnts使用5.0 mL氨水(5.0%，体积比)和20 mL水即可实现再生，可再次从茶叶中净化富集高氯酸盐，最多可重复使用20次，因此，这是一种较为环保的前处理方法. 但该方法的一些细节还在研究当中.

2.3.2 液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)分析

LC-MS-MS检测高氯酸盐时，采用负离子模式. 高氯酸盐在LC-MS-MS上有99～83、101～85和99～67三个离子对响应较高，多以99～82.9作为定量离子对，其它作为定性离子对. 内标多采用18O同位素内标，离子对为107～89和109～91. 定量的方式主要有外标定量和同位素内标定量两种方式，检出限为2～5 μg/Kg，远低于离子色谱的200 μg/Kg. LC-MS-MS检测高氯酸盐时，所使用的流动相和色谱柱对高氯酸盐的保留有很大影响，已报道的LC-MS-MS分析流动相和色谱柱的比较如表2所列.

高氯酸盐在C18柱上没有保留或保留很弱，因此，LC-MS-MS分析时，一般不使用C18色谱柱，多以阴离子或亲水性分离柱为主. 表2中9位研究者使用了不同的流动相和色谱柱，均检测出茶叶中的高氯酸盐，平均加标回收率达到93%～120.0%，分离度良好. 从文献中的MRM总离子图发现，Thermo Acclaim TRINITY P1和IC-Pak Anion HR 两根色谱柱的保留效果较好，分离度大，能将干扰较大的氯酸根、溴酸根等有效分离，且分析时间短，因此，有多位研究者应用了该类色谱柱进行分析.

表2 LC-MS-MS分析流动相、色谱柱和定量方式Table 2 Detection mobile phase, column and quantitative mode by LC-MS-MS

对流动相比较发现，在水相中均添加了5～100 mmol/L的乙酸铵和甲酸铵调节酸度，分离度更好. 由于乙腈比甲醇具有更的强洗脱力，多篇文献里的总离子图在使用乙腈作流动相时峰型更为尖锐，响应更高. 定量方式上，虽然部分研究表明直接用外标法定量，其回收率也达到了较好的效果[30,34]，但也有研究表明，其所用的水、器皿、净化小柱等均随机含有高氯酸盐[40]，因此，大量研究均使用同位素内标定量，结果更为准确.

2.3.3 LC-MS-MS检测应用

应用LC-MS-MS检测技术，多家检测机构对不同种类、批量的茶叶进行了高氯酸盐的检测. 如陈东等[36]以该方法检测了绿茶、红茶、茉莉花茶等共190份北京市售茶叶中高氯酸盐，结果有5份样品的质量分数超过0.75 mg/Kg，最高达1.6 mg/Kg，平均为0.16 mg/Kg. 李雨哲等[32]使用该方法检测了26份市售茶叶，结果有一份超过0.75 mg/Kg，达到1.8 mg/Kg. Yong-Gang Zhao等[41]将该方法应用于浙江省茶叶食品安全风险监测的240份样品中，结果有229份样品高氯酸盐的质量分数在0.082～988 μg/Kg内.

3 结论与讨论

目前报道的茶叶中高氯酸盐检测多以LC-MS-MS为主，IC和IC-MS法报道较少. 其原因是IC法检测干扰大，检出限高，不能检测低含量的样品，且易出现假阳性. IC-MS法虽较离子色谱法有很大优势，但其流动相多为无机酸碱，不能直接进入离子源，需经过抑制性转换成水，检测成本较高、操作复杂. 因此，LC-MS-MS法是目前茶叶中高氯酸盐检测使用最多的方法，并且较多适合LC-MS-MS的色谱柱也被开发出来. 经比较，LC-MS-MS法既达到了较低的检出限，又具有较高的专一性，同时减轻了重新购买仪器的经费负担，是目前检测茶叶中高氯酸盐的主导技术.

由以上综述可见，目前茶叶样品中高氯酸盐的检测存在的问题是多以加标回收的方式进行质控，虽然回收率均较高，但茶叶样品本底值很难检测准确，且试验环境中如水、器皿、试剂等均可能含有高氯酸盐. 目前并没有茶叶高氯酸盐标准样品出售，这是检测茶叶高氯酸盐质量控制的一个缺陷. 茶叶前处理中所用的净化小柱均为一次性使用，不能再生，净化成本高，且有研究表明还随机存在高氯酸盐，对结果造成影响. Yong-Gang Zhao等[41]虽使用qa-mag-ccnts应用于茶叶中高氯酸盐的预富集，净化富集效果明显，并可再生，但其合成过程复杂，需要特殊的设备合成和检验合成效果，不适用于检测机构自行制备. 因此，有待于专业的人员开发类似净化效果好、能再生、对环境友好的净化材料.

目前，尽管茶叶中高氯酸盐检测的研究报道越来越多，但我国茶叶质量标准中并无该项检测，也无国家、行业和出口检测标准或限量标准可供参考. 至今该类方法研究也仅限于个人或检测机构自行研发，各种方法的可行性还有待考证. 国内外目前都没有茶叶中高氯酸盐的检测标准和明确的限量标准可供执行和使用，因此，为了我国茶叶质量安全的保障和出口不受限制，应尽早制定茶叶中高氯酸盐的检测和限量标准.