纳米递药系统在三阴性乳腺癌综合靶向治疗中的应用

张敏娜，钟 鸣，王光辉

（1.济宁医学院药学院，山东 日照276826；2.济宁医学院司法鉴定中心，山东 济宁272013）

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）与其他乳腺癌亚型相比具有更高的异质性，表现为侵袭性、破坏力和耐药性增强，这种异质性与异常相关基因调控下肿瘤细胞雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人体表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达抑制有关［1-2］。TNBC产生耐药性的因素包括由异常基因表达引起的药物流出泵增加，细胞内药物浓度降低；细胞膜膜磷脂结构变化减少药物摄取；屏蔽或改变细胞内药物靶点等有关［3-5］，因此，常规给药治疗TNBC 的方法常难奏效。药物化疗被认为是乳腺癌治疗的有效方法，但其弊端是损伤肿瘤周围正常组织甚至其他脏器，导致严重的骨髓抑制和心脏毒性。近年来，随着纳米医学的不断飞速发展，TNBC治疗过程由单纯的纳米材料携带药物到纳米治疗体系的构建［6］发展到TNBC精准的基因诊断［7］和基因治疗［8］、光热治疗［9］、药物化疗［10］和免疫治疗［11］。纳米递药系统借助其独特的理化性质负载多种化疗药物、抑制性基因片段和免疫增强剂等，特异性光热消融肿瘤细胞效应治疗过程不良反应较轻，是目前有重要研究和开发价值的恶性肿瘤治疗策略。本文就近年来纳米递药系统在TNBC 综合治疗中的应用进行介绍，为治疗TNBC提供参考。

1 纳米递药系统在肿瘤治疗中的应用

纳米材料在疾病诊断和治疗中的应用包括药物和基因载体、诊断和治疗监测成像、肿瘤综合治疗、抑制杀灭病毒或细菌以及生物大分子检测等方面［12-13］。处于1～100 nm粒径的材料会表现为特有的理化性质，在外加激光、超声、磁场和近红外光激发等条件下发生能量转换，将激光、超声、磁场和近红外光介导的微能量转换为热能或化学能，构建精准靶向递药体系，实现负载药物的缓释效应、可控性靶向给药、治疗成像监测和光热消融功能等［14-16］。

近年来，在肿瘤治疗方面，纳米递药系统能够直接将多柔比星（doxorubicin，DOX）、多西他赛（多西紫杉醇）、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶和顺铂等药物靶向运送到肿瘤细胞中。纳米递药系统增加肿瘤细胞对药物摄取，也可以通过肿瘤细胞过表达的分子（如叶酸受体和转铁蛋白受体、CD44 分子等）精准识别靶组织（肿瘤组织）。除此之外，石墨烯纳米复合材料、金纳米粒、Fe3O4纳米粒和高分子复合纳米粒等纳米材料介导的光热效应是杀死肿瘤细胞及肿瘤干细胞的重要机制，其具体过程是在近红外照射条件下，在肿瘤细胞间和细胞内驻留的纳米载体一方面吸收近红外光，高效地转化为热能，肿瘤局部热能蓄积杀死肿瘤细胞［17-18］；另一方面可以缓控释放高剂量化疗药物对肿瘤细胞进行有效抑制和杀灭［19］。

2 光热疗法结合药物治疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用

近红外光热转换的纳米材料载体，经注射选择性释放并聚集到肿瘤组织，在近红外照射条件下，肿瘤组织和细胞内的纳米材料吸收近红外，经光热转换生成热能杀死肿瘤细胞。肿瘤周围正常组织纳米载体吸收较少，在近红外照射下损伤较小，显著提高了光热疗的安全与有效性。多功能金纳米球（multifunctional gold nanospheres，MGN）独特的空间结构和质地将近红外能转化为热能，纳米级粒径和球状结构对光具有很强的表面等离子共振吸收效应，将光能转换成热能，产生热量局部温度达到42℃，通过热效应杀灭肿瘤细胞。除此之外，低温敏感脂质体（low temperature sensitive liposomes，LTSL）在42℃条件下释放DOX参与肿瘤细胞的化疗过程。荧光共聚焦Z-stack成像和透射电镜成像证实TNBC 细胞对MGN 的摄取明显增加。进一步通过细胞活力测定和细胞荧光成像MGNDOX-LTSL治疗效果与游离DOX和仅负载DOX的脂质体相比，MGN-DOX-LTSL 治疗后肿瘤细胞存活率显著下降。值得注意的是，实验结果显示，DOX 即使在低浓度（0.5 mg·L-1）下，MGN-DOXLTSL 相对于游离DOX（死亡率17%）取得了更高的细胞死亡（死亡率33%）。MGN-DOX-LTSL 将MGN光导热疗与LTSL化疗药物递送协同进行，实现了DOX 靶外组织的毒性最小化并有望彻底根除侵袭性的乳腺癌干细胞［20］。

不同材质的纳米材料其性质有所差异，石墨烯量子点（graphene quantum dot，GQD）纳米材料属于不含高毒性金属元素的环保型材料，由于其电子在每个方向上的运动都受到限制，量子局域效应特别显著，带隙宽度范围可调，容易实现表面功能化。另外GQD具有良好的光激发产热和激发生成单线态氧的功能，在近红外区域具有最大的发射量，在肿瘤治疗成像方面显示出巨大的潜力。中空介孔二氧化硅纳米颗粒（hollow mesoporous silica nanoparticles，HMSN）包裹（at，@）GQD 经聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰后构成GQD@HMSN-PEG，此递药系统具有良好的光吸收和发射单线态氧（1O2）功能，1O2为分子氧，通过强氧化作用杀伤肿瘤细胞。另外GQD@HMSN-PEG 对DOX具有更高的载药率，更长的肿瘤保留时间和更明显的疗效［21］。

整合素α 抗体与PEG 纳米胶束的结合可促进码RNA，可调节多个基因表达使其成为治疗靶点。利用热动力学和化学稳定性的三向连接基序作为支架，携带一个与CD133 受体结合的RNA 适体和一个锁定的核酸序列来抑制miRNA21。功能分析显示癌细胞迁移减少，miRNA21 表达受到抑制，下游肿瘤基因抑制因子PTEN 和pDD4 表达上调［27］。另有研究表明，miR-205和miR-34a 对TNBC 细胞的增殖起到了较为显著的抑制作用，其中miR-205负向调控上皮间充质组织转化因子（epithelial mesenchymal transitions，EMT）相 关 转 录 因 子ZEB1 及下调HER-3的表达，从而对HER-3阳性的肿瘤发生影响。同时，通过靶向作用于细胞周期进程主要调控因子E2F1 等抑制TNBC 肿瘤细胞周期进程、增殖和肿瘤生长［28］。递送miR-34a的靶向纳米载体组除了抑制TNBC 细胞增殖，还在抑制细胞迁移方面发挥了较为明显的作用。相关研究显示，miR-34a 还可能通过下调Bcl-2 基因和沉默信息调节因子1 的表达，进一步抑制乳腺癌细胞的生长和迁移［29］。

3 基因疗法在三阴性乳腺癌治疗中的应用

基因治疗是TNBC 治疗的重要发展方向。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）为20～25 个核苷酸构成双链RNA，通过精准参与特定RNA 干扰过程调节目标基因表达。介孔有机硅（periodic mesoporous organosilicas，PMO）包裹金纳米棒（gold nanorod，GNR）构成GNR@LPMO，其特点为尺寸均匀（175 nm）、孔径大、光热转换效率高、生物相容性好等。GNR@LPMO与传统脂质体和金纳米棒相比，siRNA负载能力更强。Ni等［25］研究发现，功能性siRNA可以通过GNR@LPMO有效地传递到TNBC细胞中，进一步通过敲除polo样激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）引发肿瘤细胞凋亡。通过将有效的基因传递和光导热消融相结合，GNR@LPMO诱导小鼠肿瘤抑制率比单独治疗模式高15 倍，对耐药性肿瘤和肿瘤干细胞杀灭作用增强。siRNA干扰是有效敲低基因表达以研究各种细胞类型中蛋白功能的最佳方法，通过交替沉积siRNA和多聚L-精氨酸在纳米颗粒上形成多层膜，在纳米颗粒表面多层膜可有效负载多达3500个siRNA 分子，血清半衰期延长至28 h。经静脉给药后肿瘤靶基因表达降低80%。通过在DOX 脂质体上制备siRNA 负载膜，靶向多药耐药蛋白1 的siRNA 的有效联合疗法。体外实验结果表明，经逐层膜修饰的siRNA 的递药体系治疗后，肿瘤体积缩小87.5%，癌细胞数量显著减少［26］。

微小RNA（microRNA，miR）是一种短的非编系统内化，如耐药MDA-MB-231TNBC细胞株和4T1细胞在24 h后迁移延迟，而线粒体膜电位在高温下显著降低。在4T1原位自发转移瘤模型中，纳米胶束的瘤内给药显示，抗肿瘤和纤维化介导的封闭作用［22］。透明质酸（hyaluronic acid，HA）复合聚吡咯（polypyrrole，PPy）纳米粒子 包 裹DOX 构成的DOX@HAPPy 用于TNBC 的影像学监测和治疗。DOX@HAPPY 递药系统具有激发荧光、刺激响应药物释放和光诱导加热，治疗过程可视化追踪、肿瘤组织穿透性高等优点［23］。负载细胞膜衍生壳、亚甲蓝和顺铂的凝胶核纳米囊泡的优势在于肿瘤光声成像对比度明显，并在激光照射下产生热疗，使光热成像和深层肿瘤穿透成为可能。同时释放亚甲蓝和顺铂，癌细胞摄入亚甲蓝和顺铂增加，可有效杀伤4T1 细胞，使原发性肿瘤消退，肺转移抑制率高达97%，对动物无明显毒性［24］。

将带负电荷的纳米壳交替涂以正电多聚赖氨酸和miR-34a，有助于进入细胞和保护miR-34a。通过共聚焦显微镜、Western 印迹法和EdU细胞增殖流式分析检测纳米颗粒进入MDA-MB-231 TNBC细胞的情况。结果显示，携带miR-34a的纳米递药系统分别抑制sirt1 和bcl-2 的表达，抑制率分别为（46±3）%和（35±3）%，使肿瘤细胞增殖率降低33%［30］。TNBC 患者miR 微阵列的基因表达谱分析显示，miR-374a-5p 特异性上调。使用体外和体内模型进行的功能研究表明，上调的miR-374a-5p可促进TNBC的肿瘤进展［31］。miR-374a-5p直接靶向arrb1，arrb1 在TNBC 患者中被特异性下调。过表达的arrb1 降低了肿瘤坏死细胞的生长和迁移，arrb1 的表达水平与乳腺癌的组织学分级呈负相关，与肿瘤坏死细胞的存活呈正相关；增加的arrb1激活了TNBC 细胞中的腺苷酸激活蛋白激酶，与miR-374a-5p 的表达有关［32］。聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）和 聚 乳 酸（polylactic acid，PLGA）共同修饰的HA纳米复合物HA-PEI-PLGA，负载DOX 和miR-52-3P，平均粒径为131.7 nm，药物包封率高，可防止血清中miR-52-3P的降解。体外实验结果显示，HA-PEI-PLGA一方面增加TNBC细胞MDA-MB-231 对DOX 的摄取，另一方面HAPEI-PLGA负载的miR-52-3P通过靶向肿瘤抑制基因p53 和凋亡抑制因子存活蛋白促进TNBC 细胞凋亡［33］。

4 免疫疗法结合药物化学治疗在三阴性乳腺癌治疗中的应用

乳腺癌肺转移是TNBC 患者死亡主要原因，抗转移是癌症治疗中的一个严峻的挑战，而免疫系统的激活在转移性癌症治疗中意义重大。用高整合MSN（highly integrated mesoporous silica nanoparticles，HIMSN）包裹DOX 的递药系统DOX@HIMSN 治疗TNBC中发现，DOX@HIMSN可以诱导树突状细胞的成熟和抗肿瘤细胞因子的释放，提高肿瘤细胞毒性和激发抗肿瘤免疫反应的作用［34］。

精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸肽（Arg-Gly-Asp，RGD）借助酰胺键偶联DOX 和丝裂霉素C 与聚合物脂质纳米颗粒（polymer-lipid nanoparticles，PLN）构成递药系统RGD-PLN，体外诱导肿瘤细胞形态学改变，对肿瘤细胞毒性增强；靶向肿瘤间充质血管和实质癌细胞，而在肺转移中显示出高浓度聚集。影像学实验结果显示，与游离药物（对照组）相比，RGD-PLN 10 mg·kg-1静脉给药组和非靶向PLN 给药组的肺转移灶数目分别减少31%和4.7%，肺转移面积指数减少4.0%和2.4%，显著抑制肺转移且延长宿主的存活时间［35］。

TNBC 与健康乳腺组织相比，白细胞介素6 表达增加，共聚焦显微镜显示，肿瘤细胞中DOX-HA-超顺磁性氧化铁纳米颗粒比DOX常规给药（游离状态），癌细胞细胞质中药物含量更高。用电子显微镜观察形态学变化发现促进细胞凋亡作用明显。ELISA 法实验结果显示，促炎介质白细胞介素6 和NF-κB 表达显著下调［36］。另有研究将4T1 小鼠乳腺癌细胞注射到BALB/c 雌性小鼠的侧面，用肿瘤坏死因子α、DOX 和二者联合治疗。结果显示，在4T1荷瘤小鼠中，肿瘤坏死因子α预处理的DOX纳米胶束明显提高肿瘤组织化疗药物含量［37］。利用纳米递药系统的优势，可同时负载和传递具有不同理化性质的激活免疫系统的细胞因子和化疗药物，实现协同抗肿瘤作用。将细胞因子白细胞介素2吸附在负载DOX 的纳米囊泡经静脉注射荷瘤小鼠可明显抑制肿瘤生长。干扰素γ明显抑制TNBC原发肿瘤生长和肺转移，进一步促进树突状细胞成熟，促进CD8+T淋巴细胞和自然杀伤细胞浸润活化，增加CD45+免疫细胞和Ly6G+中性粒细胞的募集，有效抑制TNBC肿瘤细胞［38］。

5 结语

三阴性乳腺癌综合靶向纳米递药系统还可以负载增殖信号通路关键酶抑制剂ZD6474［39］、顺铂/多西紫杉醇［40］、5-氟尿嘧啶［41、Pd［DMBil1］-PEG750光敏剂［42］、miR708 和miR34a 肿瘤增殖抑制基因［43-44］等，通过多种途径和机制抑制肿瘤的增殖和转移（表1），有效遏制肿瘤细胞及其耐药克隆细胞的生长、转移和复发。纳米递药系统综合靶向疗法对TNBC 治疗的意义包括：①光热疗法结合化疗药物多途径抑制和杀灭TNBC 细胞，尤其是对肿瘤干细胞的清除力度加大，有望解决肿瘤的增殖、转移和复发问题；②基因疗法与纳米技术的结合，TNBC治疗更加精准和智能化；③纳米递药系统同时实现了免疫疗法和药物疗法的结合，有效控制肿瘤的血管形成和浸润正常组织；④纳米材料选择性高，组织相容性好，对正常组织的影响较小。

当前纳米递药系统存在的不足和局限主要集中在2 个方面：一是纳米载体的释放药物方面需要克服肿瘤微环境限制，纳米递药系统发挥作用必须克服肿瘤组织渗透局限性、肿瘤组织局部渗透压屏障、药物表面电荷屏障、异质性肿瘤细胞耐药克隆日益严重等问题［45］；二是纳米材料具有在体内循环周期长、非线性药物代谢动力特征、组织器官分布广泛等特性，给药物代动力学和纳米材料毒物代谢动力学研究带来了新的挑战。尽管纳米递药系统付诸临床应用尚存多种局限，相信随着纳米材料体内代谢研究的不断完善和三阴性乳腺癌药物靶点的深入研究，集基因治疗、光热治疗、药物化疗和免疫治疗于一体的综合靶向纳米递药系统将会为TNBC的临床治疗提供更多样、更高效、更精准和更智能的治疗策略。

表1 纳米递药系统在三阴性乳腺癌（TNBC）治疗中的应用