补骨脂酚在大鼠和人肝微粒体中细胞色素P450酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶代谢稳定性及性别差异

张 涛，杨津兰，朱 安，赵经纬，王 旗，2，3

（1.北京大学公共卫生学院毒理学系，北京100191；2.国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室，北京100191；3.食品安全毒理学研究与评价北京市重点研究室，北京100191）

补骨脂酚（bakuchiol）是补骨脂的主要活性成分之一，具有广泛的药理活性，如降糖和降血脂作用、抗炎作用［1-3］、抗菌作用［4-8］、抗氧化作用［9-10］、抗癌作用［11-12］和植物雌激素样作用［13-15］等，在治疗糖尿病、肝硬变、乳腺癌和绝经后骨质疏松等方面具有较大的应用潜力。张昀等［16］研究发现，补骨脂酚在雌、雄性大鼠体内的代谢速率有差异。赵子婧等［17-18］对SD大鼠ig给予补骨脂水煎液（40 g·kg-1）和补骨脂酚（200 mg·kg-1），发现补骨脂酚在雌、雄性大鼠体内的毒代动力学参数存在明显差异，雌性大鼠血浆清除率均慢于雄性大鼠。补骨脂酚在大鼠体内代谢动力学过程有性别差异，迄今为止未见其在人体内代谢的研究报道。体外代谢研究中，焦士勇等［19］研究了补骨脂酚在雄性大鼠、比格犬和人肝微粒体中细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶的代谢稳定性和代谢动力学，并比较了种属差异。除了CYP 酶参与补骨脂酚的代谢外，Li 等［20］研究表明，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）也参与了补骨脂酚的代谢。目前尚无CYP酶和UGT酶同时参与补骨脂酚的体外代谢研究报道。研究该2种酶对补骨脂酚的代谢性质和性别差异，有助于了解其在体内的代谢，对指导临床合理用药具有重要意义。本研究应用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法，研究补骨脂酚在大鼠和人肝微粒体中CYP酶和UGT酶介导的代谢反应的代谢稳定性，并比较代谢的性别和种属差异。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

补骨脂酚购自南京泽郎医药科技有限公司，纯度＞99%。丹参酮ⅡA（内标）、奥美拉唑（CYP2C19特异性底物）和丙甲菌素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；奥沙西泮标准溶液（1 g·L-1）（UGT2B15 特异性底物）购自英国LGC 公司；Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司；雌、雄性SD 大鼠肝微粒体和男、女性人肝微粒体购自北京汇智泰康生物技术有限公司，蛋白浓度为20 g·L-1；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、尿苷-5′-二磷酸葡萄糖醛酸（uridine 5′-diphosphoglucuronic acid，UDPGA）和D-葡萄糖二酸1，4-内酯（一水）购自美国Sigma 公司；甲醇和乙腈为色谱纯，购自美国Fisher 公司；DMSO 购 自 美 国Amresco 公 司；甲 酸、KH2PO4、K2HPO4·3H2O 和MgCl2·6H2O 均为国产分析纯，实验用水为超纯水。Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Ultimate XS-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Welch公司）；FLUO star Omega 多功能酶标仪（德国BMG LABTECH公司）；十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；涡旋混合器（美国Scientific Industries 公司）；Thermo Micro 17R 高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific 公司）；Milli-Q 纯水器（美国Millipore 公司）；KQ3200DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 肝微粒体代谢孵育体系

1.2.1 NADPH启动的Ⅰ相代谢反应体系

孵育体系用100 mmol·L-1的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4，含MgCl25 mmol·L-1）配制，孵育总体积为200 μL，其中含肝微粒体（终浓度为0.5 g·L-1）和补骨脂酚（初始浓度为10 μmol·L-1）。上述孵育体系在37 ℃预孵育5 min，加预孵育5 min的NADPH（终浓度为1 mmol·L-1）溶液启动Ⅰ相代谢反应。孵育体系中DMSO不超过0.1%。

1.2.2 UDPGA启动的Ⅱ相代谢反应体系

孵育体系用100 mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4，含MgCl25 mmol·L-1）配制，孵育总体积为200 μL，其中含肝微粒体（终浓度为0.5 g·L-1）、丙甲菌素（终浓度为25 mg·L-1）、D-葡萄糖二酸1，4-内酯（终浓度为5 mmol·L-1）和补骨脂酚（初始浓度为10 μmol·L-1）。先将孵育体系置冰上15 min，为内质网膜“打孔”活化葡萄糖醛酸转移酶，然后在37℃预孵育5 min，加预孵育5 min的UDPGA（终浓度为5 mmol·L-1）溶液启动Ⅱ相代谢反应。孵育体系中DMSO不超过0.1%，甲醇不超过0.1%。

1.2.3 NADPH 和UDPGA 共同启动的两相代谢反应体系

孵育体系加入在37℃预孵育5 min 的NADPH（终浓度为1 mmol·L-1）和UDPGA（终浓度为5 mmol·L-1）溶液启动两相代谢反应，其余同Ⅱ相代谢反应体系。

1.3 孵育方案和样品处理

上述各孵育体系在37℃水浴中进行孵育，分别于0，2，5，10，20，30 和60 min 加冰冷的200 μL 含内标（0.5 μmol·L-1丹参酮ⅡA）的甲醇-乙腈（1∶1，V∶V）溶液终止反应，0 时组用灭活的微粒体代替正常微粒体。涡旋混匀2 min，于17 000×g，4℃离心15 min，各取上清20 μL HPLC进样分析，检测各时间点补骨脂酚的剩余量。

1.4 HPLC法测定条件

流动相为甲醇-0.1%甲酸水（89∶11，V∶V），流速为1 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长262 nm，进样量20 μL。

1.5 数据处理和分析

以0 min时的补骨脂酚浓度为100%，计算不同时间点的补骨脂酚剩余浓度，与0 min 时浓度相比得到其剩余百分比。用GraphPad Prism 7 软件自建单指数降解模型，详见式（1），各时间点补骨脂酚剩余百分比为Y，时间为X，对数据进行非线性拟合，求得底物消除速率常数（-k），由式（2）得到补骨脂酚的代谢消除半衰期t1/2，按式（3）和式（4）计算补骨脂酚的固有清除率Clint和肝清除率Clh［21］。

其中，WML表示每g肝组织中含有的微粒体蛋白的平均质量（mg·g-1），WLB表示每kg体质量中肝的平均质量（g·kg-1），Qh表示肝血流量（mL·min-1·kg-1），c蛋白表示反应体系中的蛋白质浓度（g·L-1），相关参数值引自文献［22］（表1）。

Tab.1 Parameters in hepatic clearance calculation

2 结果

2.1 HPLC检测方法学验证

2.1.1 专属性

HPLC 图谱见图1，微粒体中的内源性物质不干扰补骨脂酚和内标的测定，补骨脂酚和内标可完全分离且峰形良好，保留时间分别为7.9和9.1 min。

2.1.2 线性范围和检测限

用最小二乘法进行线性回归，求得回归方程Y=0.7763X+0.3202，R2=0.9935，补骨脂酚在0.2～20 μmol·L-1浓度范围内线性关系良好，测定下限为0.2 μmol·L-1。

2.1.3 准确度和精密度

测定的日内和日间精密度＜8.5%，准确度在-4.6%～17.8%的范围内，提取回收率＞98%，表明本研究采用的样品测定方法准确可靠，符合要求。

2.2 补骨脂酚在大鼠和人肝微粒体中的代谢

不加NADPH 或UDPGA 时，补骨脂酚在大鼠和人肝微粒体中不发生代谢（图2A和B），表明其肝微粒体代谢是NADPH/UDPGA 依赖的。补骨脂酚分别与不同性别、种属肝微粒体孵育，其代谢消除曲线见图2。补骨脂酚在SD 大鼠和人肝微粒体中均会发生CYP酶介导的Ⅰ相反应和UGT酶介导的Ⅱ相反应，且代谢反应速率存在性别、种属差异。通过非线性拟合得到底物消除速率常数（-k），计算补骨脂酚在肝微粒体中的消除半衰期t1/2和固有清除率Clint，推导得到肝清除率Clh，其代谢参数见表2和表3。

Fig.1 HPLC chromatograms of bakuchiol in liver microsomes.A：blank rat liver microsomes；B：blank rat liver microsomes spiked with bakuchiol；C：incubation of bakuchiol with rat liver microsomes；1：bakuchiol；2：internal standard；mAU：mili absorbance unit.

Fig.2 Gender differences in metabolic elimination profiles of bakuchiol in rat liver microsomes（RLMs）and human liver microsomes（HLMs）without nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）and uridine 5′-diphosphoglucuronic acid（UDPGA）（A，B）and in presence of NADPH（C，D），UDPGA（E，F）or both of them（G，H）.Bakuchiol（10 μmol·L-1）was incubated with liver microsomes at the protein content of 0.5 g·L-1 and other constituents.After 0，2，5，10，20，30 and 60 min of incubation at 37℃，the reactions were stopped by addition of 200 μL methanol-acetonitrile（1∶1）containing 0.5 μmol·L-1 tanshinone ⅡA（internal standard）.After vortexing for 2 min，the sample was centrifuged at 17 000×g for 15 min（4℃）.A 20 μL aliquot of the supernatant was analyzed by HPLC.s，n=3.

Tab.2 Metabolic clearance parameters of bakuchiol in RLMs

Tab.3 Metabolic clearance parameters of bakuchiol in HLMs

在SD 大鼠肝微粒体中，补骨脂酚经CYP 酶介导的Ⅰ相代谢反应Clint，雄性〔（326.6±15.4）mL·min-1·kg-1〕显著高于雌性〔（77.2±4.8）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）；UGT 酶介导的Ⅱ相代谢反应Clint，雌性〔（419.1±24.1）mL·min-1·kg-1〕显著高于雄性〔（164.5±8.4）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）；两种酶同时介导的联合代谢反应Clint，雄性〔（1063.1±27.2）mL·min-1·kg-1〕显著高于雌性〔（781.2±16.5）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）。

在人肝微粒体中，补骨脂酚经CYP酶介导的Ⅰ相代谢反应Clint，男性〔（24.8±2.1）mL·min-1·kg-1〕显著高于女性〔（17.6±1.0）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）；UGT 酶 介 导 的Ⅱ相 代 谢 反 应Clint，男 性〔（176.4±26.5）mL·min-1·kg-1〕和女性〔（165.9±8.6）mL·min-1·kg-1〕无显著性别差异；两种酶同时介导的联合代谢反应Clint，男性〔（262.5±20.9）mL·min-1·kg-1〕和女性〔（236.2±10.5）mL·min-1·kg-1〕无显著性别差异。

3 讨论

在参与药物代谢的各类酶中，CYP酶为主要代谢酶（75%），其次为UGT 酶（15%）［23］。李艾芳等［24］、胡 小 婧 等［25］和Chi 等［26］研 究 结 果 表 明，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19 和CYP3A4 均参与了补骨脂酚的代谢。Li等［20］研究结果提示，UGT1A1，UGT1A3 和UGT2B15 为补骨脂酚的主要代谢酶。因此，对补骨脂酚的体外代谢酶研究应重点关注CYP 酶和UGT酶。本研究通过体外代谢稳定性实验，对补骨脂酚分别在不同性别SD 大鼠和人肝微粒体发生CYP 酶、UGT 酶介导及两者同时介导的代谢反应进行系统考察，并比较代谢酶贡献差异及代谢的种属和性别差异。

本研究表明，SD 大鼠肝微粒体对补骨脂酚的代谢清除具有显著性别差异，雄性SD 大鼠肝微粒体对补骨脂酚的代谢以CYP 酶介导的Ⅰ相反应为主，雌性SD 大鼠肝微粒体发生的代谢以UGT 酶介导的Ⅱ相反应为主。当该两种酶同时介导、发生联合代谢反应时，雄性Cl显著快于雌性。本课题组赵子婧等测定SD大鼠iv给予补骨脂酚50 mg·kg-1的血浆药动学参数，雄、雌性SD大鼠的清除率分别为4.96±1.58和（3.98±0.58）L·h-1·kg-1（待发表），本研究结果与此相近〔3.15±0.00和（3.09±0.00）L·h-1·kg-1〕，提示补骨脂酚在大鼠体内以CYP酶和UGT酶介导的代谢反应为主。补骨脂酚在雄、雌性SD 大鼠肝微粒体中发生的代谢反应主要类型及代谢速率均出现显著的性别差异，这可能与参与补骨脂酚代谢的酶在雄、雌性SD大鼠体内含量不同有关［27］。

与大鼠肝微粒体不同，补骨脂酚在人肝微粒体中发生的代谢主要类型和代谢速率的性别差异较小，仅CYP酶介导的Ⅰ相代谢反应出现显著的性别差异，男性代谢略快于女性。由于参与补骨脂酚Ⅰ相反应的主要CYP 酶，如CYP2C19，CYP1A2 和CYP3A4，均表现出明显的基因多态性，尤其是CYP2C19最为典型［28］。因而对于不同性别的人肝微粒体，参与补骨脂酚代谢的CYP同工酶活性可能存在差异，从而影响其代谢速率。由于补骨脂酚在人肝微粒体中发生的代谢以代谢速率无显著性别差异的Ⅱ相代谢反应为主，当这两种酶同时作用时，补骨脂酚的代谢速率仍无显著性别差异，提示补骨脂酚在人体内的代谢可能无显著性别差异。补骨脂酚具有一定的肝和肾细胞毒性［29-31］，在人体内虽可较快地进行代谢消除，由于其脂溶性较高，有可能会在人体中产生蓄积，对肝、肾功能产生损害作用。长期用药时，仍需要警惕补骨脂酚潜在的肝和肾毒性风险。

药物代谢大多在肝中进行，体外肝微粒体代谢法是研究药物体外代谢的主要技术和方法，常采用雄性大鼠或男性人肝微粒体进行体外代谢研究。由于CYP酶参与了大多数药物的代谢，对代谢酶的考察也常优先考察CYP 酶的代谢作用。本研究表明，对于多种酶参与代谢的药物，如补骨脂酚，仅研究其在大鼠或人肝微粒体中发生CYP 酶介导的代谢反应，会严重低估其在大鼠或人体内实际的代谢速率，从而对其代谢作出错误的判断。因此，当使用药物的体外代谢实验数据预测其在体内的代谢时，需首先考察各种酶对药物是否具有代谢作用，在此基础上尽可能将参与代谢的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶纳入研究范畴，以免对药物的实际代谢情况作出错误的评估。对于体内代谢研究，将大鼠的研究结果进一步外推至人体时，需要注意在大鼠体内代谢有性别差异的药物，在人体内代谢不一定也存在性别差异。