LKB1/Akt/mTOR通路介导调控胶质瘤细胞对抗EGFR抑制剂耐药研究

(中国人民解放军陆军第八三集团军医院，河南 新乡 453000)

胶质瘤是一种常见的预后较差的脑肿瘤，其中包括成年胶质母细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤、儿童胶质母细胞瘤和弥漫性内分泌神经胶质瘤[1]。其五年生存率为0%～60%，迫切需要新的治疗方法[2]。EGFR基因扩增在胶质瘤中常见，但EGFR TKI疗效欠佳[3]。一项Ⅲ期临床试验结果表明，新诊断的EGFRvIII表达的胶母患者使用Rindopepimut 生存期未延长。Rindopepimut对胶母患者的免疫疗效可能需要通过联合用药来实现。一项Ⅱ期临床试验结果表明，成人复发低级别胶质瘤使用mTOR抑制剂依维莫司后疾病较稳定，6个月PFS为84%，12个月PFS为47%。依维莫司的抗肿瘤作用同时存在肿瘤血管结构异常。以上结果支持依维莫司在低级别胶质瘤中做进一步探索。研究旨在解析胶质瘤细胞对EGFR TKI的疗效，以及探讨LKB1/Akt/mTOR信号通路在胶质瘤细胞对抗EGFR TKI的耐药的作用和分子机制，这为胶质瘤EGFR TKI等靶向治疗提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

选用SPF级别的BALB/C荷瘤鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，雄性，体重18～22 g，6～8 周龄，在SPF 级条件下无菌层流饲养，恒温恒湿，所有的饮用水和食物均进行灭菌。所有动物实验操作符合动物实验标准操作规程，遵循实验动物伦理委员会相关规定。Western Blot所需试剂购自中国碧云天公司；pEGFR/EGFR抗体，pAkt/Akt抗体，pS6K/S6K抗体，pERK/ERK抗体，pSTAT3/STAT和LKB1抗体和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均购于美国Bioworld公司。厄洛替尼，LKB抑制剂1093222-27-5和Akt抑制剂LY294002购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养

胶质瘤细胞株U87购自美国标准菌库(American type culture collection, ATCC)；稳定表达EGFRvIII的U87细胞株由天津医科大学提供。U87细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中加入100 U/mL的青霉素和100 U/mL的链霉素，置于培养条件为37 ℃，5% CO2的培养箱中进行常规培养。

1.3 MTT法

细胞以5 000个/孔的密度种植于96孔板内，当细胞生长融合达70%时，给予细胞相应处置，细胞转染48 h后给予相应药物处理，若无需转染直接用药物处理24 h，然后进行检测。为了避免药物处理时间过长导致混杂因素过多，药物处理时间不超过24 h。药物处理时间达到预定时，每孔加入10μL MTT，在37℃孵育4 h，终止培养。弃掉孔内液体，避光条件下加入200 μL 二甲基亚砜，放置摇床晃动10 min使结晶物充分溶解。用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光度值，并记录结果。

1.4 Western Blot

建模6 h、24 h和48 h后处死大鼠，剥离海马到EP管内放置-80℃冰箱中储存。复苏后将组织研磨并加入RIPA裂解在SDS-PAGE电泳凝胶上分离。转移到PVDF膜，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h。ECL检测标记信号。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 厄洛替尼上调AKT和S6K蛋白磷酸化水平

检测厄洛替尼作用于EGFR野生型U87细胞和EGFRvIII U87细胞，Western Blot检测可见pEGFR表达水平显著降低，而AKT和S6K蛋白磷酸化水平明显增加，同时可见ERK和STAT3磷酸化水平无明显变化。见图1。采用siRNA 下调LKB，与对照组相比，厄洛替尼增加的Akt和S6K磷酸化水平受到显著抑制。见图2。

图1 厄洛替尼作用于EGFR野生型和EGFRvIII U87细胞的蛋白

图2 LKB siRNA处理厄洛替尼Akt和S6K蛋白磷酸化

2.2 LKB抑制剂和Akt抑制剂可克服厄洛替尼耐药

厄洛替尼并未改变胶质瘤细胞的EGFR野生型U87细胞和EGFRvIII U87细胞活性，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。LKB抑制剂和Akt抑制剂明显降低肿瘤活性，而MEK抑制剂并无相关作用。见图3。

图3 厄洛替尼作用于EGFR野生型和EGFRvIII U87细胞活性

2.3 LKB抑制剂和Akt抑制剂联合厄洛替尼抑制荷瘤鼠肿瘤增长

采用EGFR野生型U87细胞种植荷瘤鼠，与对照组相比，厄洛替尼联合LKB抑制剂可显著降低肿瘤生长，如图4a所见，而厄洛替尼、LKB抑制剂并不影响荷瘤鼠肿瘤大小。与对照组相比，厄洛替尼联合Akt抑制剂可显著降低肿瘤生长，如图4b所见，而厄洛替尼、Akt抑制剂并不影响荷瘤鼠肿瘤大小。

图4 厄洛替尼联合LKB/Akt抑制剂作用于荷瘤鼠

3 讨论

目前肿瘤治疗为精准靶向和个体化治疗，尤其是在基因突变较少的儿童低级别胶质瘤中，MAPK信号通路BRAF基因变异常见胶质瘤中[2]。BRAF V600E突变的低级别儿童胶质瘤患者对常规放化疗不敏感，10年的无进展生存率(DFS)为27% ，显著低于BRAF野生型60.2%[3]。儿童胶母中较常见的致癌基因融合约占10%，MET基因融合激活MAPK信号通路，破坏细胞周期调控，诱导肿瘤进展[3]。MET抑制剂的模型研究发现其能抑制MET突变的肿瘤生长。PI3K/ATK/mTOR信号通路的抑制在一项Ⅱ期临床试验结果表明，成人复发低级别胶质瘤使用mTOR抑制剂依维莫司后疾病较稳定。本研究检测厄洛替尼作用于EGFR野生型U87细胞和EGFRvIII U87细胞，Western Blot检测可见pEGFR表达水平显著降低，而AKT和S6K蛋白磷酸化水平明显增加，同时可见ERK和STAT3磷酸化水平无明显变化。采用siRNA 下调LKB，与对照组相比，厄洛替尼增加的Akt和S6K磷酸化水平受到显著抑制。厄洛替尼并未改变胶质瘤细胞的EGFR野生型U87细胞和EGFRvIII U87细胞活性，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。LKB抑制剂和Akt抑制剂明显降低肿瘤活性，而MEK抑制剂并无相关作用。此外，还有其他靶向治疗药物，比如CDK4/6 抑制剂帕布利昔布，其可抑制mTOR下游信号通路活性，使mTOR信号通路激活。依维莫司抑制mTOR通路，激活Ras的介导ERK，帕布利西布可结合抑制ERK。依维莫司与帕布利昔布组合治疗显著干扰了胶质母细胞瘤(GBM)的代谢，导致大量细胞凋亡，且依维莫司显著提高了帕布利昔布在脑中的浓度。CDK4/6与mTOR抑制剂对GBM有治疗潜力，建议开展临床试验进一步评估。DS7423为PI3K/mTOR双靶点抑制剂, 在小鼠中能穿越血脑屏障。DS7432对PI3K通路激活且PTEN失活的胶母细胞系有抑制作用[4，5]。NVP-BEZ235是 PI3K/mTOR 双靶点抑制剂, 能增强放疗对成人和儿童胶母细胞系中的杀伤作用并导致早期的肿瘤代谢改变，此变化通过核磁共振光谱呈现。随着一代mTOR抑制剂雷帕霉素、二代mTOR抑制依维莫司等的涌现，耐药问题也随之而来，而三代mTOR抑制剂Rapalink-1的研究为耐药问题带来曙光。

总之，本研究表明LKB1/Akt/mTOR通路参与胶质瘤细胞对EGFR TKI耐药，通路抑制剂可改善TKI耐药，这为胶质瘤克服EGFR TKI靶向治疗提供理论依据。