银屑平丸对小鼠银屑病样模型血清白细胞介素-18和白细胞介素-22表达的影响

彭丹，李小鹏，席建元，谢汶芳

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

近年来大量研究表明，免疫机制的异常在银屑病的发病过程中起着重要的作用。由于免疫机制的调节主要是通过多种细胞因子之间相互作用来实现，因此细胞因子网络在银屑病发病机制中的作用已成为银屑病研究的热点之一。前期笔者发现白细胞介素（IL）-17和IL-23与银屑病样小鼠模型的银屑病面积和严重程度指数（PASI）评分呈正相关，且银屑平丸可以明显降低银屑病样小鼠模型血液中这2个因子的含量[1]。本研究在前期的工作基础上，通过IL-18和IL-22这2种重要的炎症介质，进一步探讨银屑平丸干预银屑病的可能机制，评价银屑平丸对银屑病的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 48只健康的SPF级雌性的BALB/c小鼠，体质量 18～20 g，周龄 8～12 周，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，由湖南中医药大学实验动物中心提供[动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。编号：NO.43004700003224]。小鼠饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验中心。

1.1.2 实验药物 银屑平丸（组成：生地黄、牡丹皮、紫草、丹参、白花蛇舌草、半枝莲、大青叶、山药、女贞子、旱莲草、白鲜皮、甘草），60 g/瓶。功效：凉血养阴，活血解毒。主治：银屑病，副银屑病，红皮病，毛发糠疹等皮肤病。由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供；雷公藤多苷片，湖南千金协力药业有限公司生产，国药准字号：Z43020138，规格：10 mg；5%咪喹莫特乳膏，湖北科益药业股份有限公司生产，国药准字号：H20040，规格：5 g。

1.1.3 实验试剂 IL-18和IL-22酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒由武汉博士德生物工程公司生产；酶标仪、MoticB5显微摄像系统、MIAS医学图象分析系统等实验仪器设备均由湖南中医药大学实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模 将48只小鼠用剃毛器剔除背毛，面积约3 cm×4 cm大小，除空白对照组小鼠外，余各组小鼠均用适量5%咪喹莫特乳膏外涂，1次/d，连续用药8 d，末次给药后24 h观察小鼠背部皮损的变化，处死小鼠后取小鼠背部皮肤作病理生理切片。

1.2.2 造模评价 末次给药后观察各组小鼠背部皮肤的变化，采用校正PASI评分法记录各组小鼠背部皮肤PASI评分结果，处死小鼠后取小鼠背部皮肤用10%多聚甲醛溶液固定，作石蜡包埋、病理生理切片，常规HE染色，光镜下评价小鼠皮肤病理生理变化。

1.2.3 动物分组 将实验组48只BALB/c小鼠采用随机分组法分为6组，分别为：空白对照组、模型对照组、雷公藤多苷组、银屑平丸高剂量组、银屑平丸中剂量组、银屑平丸低剂量组，8只/组。

1.2.4 动物给药 按临床给药标准，银屑平丸患者临床每日用量为45 g生药，按照平均60 kg体质量计算，患者平均用药量为0.75 g/kg，按照常用实验动物与人的体表面积比值表换算，高剂量组小鼠的灌胃剂量为12.98 g/kg，中剂量组小鼠的灌胃剂量为6.49 g/kg，低剂量组小鼠的灌胃剂量为3.25 g/kg。其中中剂量相当于临床等效剂量，是高剂量的1/2，是低剂量的2倍。雷公藤多苷片，小鼠用量为临床等效剂量，为10 mg/kg。

将雷公藤多苷片溶于蒸馏水，配成药物浓度为10 mg/kg的药液，将银屑平丸粉末与蒸馏水混合搅匀，配成药物浓度分别为12.98、6.49、3.25 g/kg的药液。空白对照组小鼠用0.4 mL生理盐水灌胃，1次/d，62.5 mg凡士林乳膏背部外涂，1次/d；模型对照组小鼠用0.4 mL生理盐水灌胃；雷公藤多苷组小鼠用0.4 mL雷公藤多苷溶液药液灌胃；银屑平丸高、中、低剂量组小鼠用0.4 mL高、中、低剂量银屑平丸溶液药液灌胃，1次/d，同时各组小鼠62.5mg5%咪喹莫特乳膏背部外涂，1次/d，连续给药8 d。

1.2.5 动物取材 末次给药24 h后，采用摘取小鼠眼球取血法，每只小鼠取血0.8～1.0 mL，将血液立即在4℃下进行离心2 000转/min共10 min后吸取上层血清，将其保存于-20℃，用于检测细胞因子IL-18和 IL-22。

1.2.6 细胞因子检测 采用ELISA法对各组小鼠血清中细胞因子IL-18和IL-22进行检测，操作步骤严格按照说明书进行，酶标仪检测。

1.3 统计学分析 运用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行统计分析。实验数据用均数±标准差（±s）表示，完全随机设计的单变量计量资料多样本符合正态性和方差齐性采用单因素方差分析方法，不满足正态性和方差齐性则采用Kruskal-WallisH检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 在整个实验过程中，小鼠在每天灌胃、涂药前精神状态均正常，饮水、饮食可，活动度正常，灌胃、涂药后活动稍减弱，0.5 h后均恢复正常。

2.2 小鼠血清IL-18、IL-22水平分析对比 模型组小鼠血清中IL-18、IL-22水平高于空白对照组小鼠及雷公藤多苷组和银屑平丸组，雷公藤多苷组与银屑平丸中、高剂量组IL-18、IL-22水平差异无统计学意义，与银屑平丸低剂量组差异有统计学意义，银屑平丸中、高剂量组IL-18、IL-22水平差异无统计学意义，与银屑平丸低剂量组差异有统计学意义，表明雷公藤多苷及中、高剂量银屑平丸可降低小鼠血清中IL-18、IL-22水平。见表1。

表1 各组小鼠血清中IL-18、IL-22水平的检测结果 （±s）

表1 各组小鼠血清中IL-18、IL-22水平的检测结果 （±s）

注：与空白对照组比较*P＜0.05；与模型对照组比较#P＜0.05；与雷公藤多苷组比较▲P＞0.05；与银屑平丸中剂量组比较△P＞0.05。

组别 n IL-18（ng/mL） IL-22（ng/mL）空白对照组 7 113.98±21.22 107.32±32.05模型对照组 7 233.83±42.82* 244.53±40.45*雷公藤多苷组 6 165.51±26.12# 155.07±33.90#银屑平丸中剂量组 6 158.29±20.23#▲ 162.68±29.08#▲银屑平丸低剂量组 7 200.50±36.81# 202.08±33.42#银屑平丸高剂量组 5 154.02±25.07▲△ 157.38±26.46▲△

3 讨论

银屑病是一种常见并易复发的慢性炎症性、免疫性皮肤病，以红斑和鳞屑为主要临床特征。中医学认为银屑病的发病可辩证分型为血热、血瘀、血燥，血热是银屑病发病的直接病因，血瘀是银屑病发生发展的重要病理环节，血燥伤阴是银屑病的重要病因病机。针对银屑病患者以血热为主，极易挟瘀、挟毒、伤阴的特点，并根据现代药理学，在犀角地黄汤的基础上减去犀角，配伍了白花蛇舌草、半枝莲、大青叶清热解毒，丹参、紫草活血化瘀，女贞子、旱莲草、山药养阴润燥，白鲜皮清热祛风解毒，甘草调和诸药，而制成银屑平丸。全方共奏凉血养阴，活血解毒之功。前期研究银屑平丸可能通过调节免疫、抑制炎症因子产生、抗炎、改善微循环而达到治疗银屑病的作用[3-4]；通过观察37例寻常型银屑病患者在银屑平丸治疗前后PASI评分以及检测外周血清IL-2、干扰素（IFN）-γ的变化，认为银屑平丸可改善银屑病患者皮损且能降低银屑病患者外周血清IL-2、IFN-γ的水平，从而进一步推断银屑平丸治疗银屑病的机制可能与调节患者免疫机制有关[5]；通过实验研究银屑平丸对豚鼠银屑病样模型血管内皮生长因子（VEGF）和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平的影响，发现银屑平丸可以降低豚鼠耳部组织匀浆中VEGF和TNF-α的表达水平，再一次证实银屑平丸可以调节免疫系统，同时还可以抗新生血管生成，从而对银屑病发挥治疗作用[6]。

IL-18属于Th1类细胞因子，是一种新型的细胞因子，其主要由吞噬细胞分泌，对慢性炎症性疾病有着重要的作用。IL-18可直接刺激NK细胞，促进INF-γ的合成，激活淋巴细胞和巨噬细胞，促进IL-2、TNF-α、IFN-γ 等 Th1 型细胞因子的分泌[7]，同时还可以调节Th1细胞的分化发育[8]。IL-18的过度表达会通过作用于Th1细胞而增强FasL介导的细胞毒作用[9]，从而启动细胞凋亡。IL-18还能促进血管的生成，抑制肿瘤的生长和转移。有学者发现寻常型银屑病患者外周血清中IL-18及IFN-γ的表达水平显著高于正常人，其浓度变化与PASI评分有相关性，且与IFN-γ水平呈正相关。以上研究不仅提示IL-18在银屑病发病中有重要作用，还可认为其是银屑病病情活动的指标之一[10]。

IL-22同样是一种重要的免疫细胞因子，IL-22可与IL-17协同促进角质形成细胞表达IL-8以及CCL20，诱导炎症细胞的浸润，还能上调角蛋白17免疫调节因子的表达，使自身免疫性T细胞激活，诱导转化Th细胞免疫应答类型，从而起到免疫调节作用[11]，李雅琴[12]通过ELLSA检测出IL-22在银屑病患者外周血中的表达水平较健康人升高，且病情处于进行期时会高于静止期，表明IL-22的表达水平与病情严重程度有相关性。

本次研究发现，IL-18和IL-22在咪喹莫特小鼠银屑病样模型和银屑病患者外周血的异常表达是一致的，银屑平丸能通过降低外周血清中IL-18和IL-22因子的表达水平，起到调节免疫的作用，从而达到治疗银屑病的目的，这为银屑平丸的进一步开发提供了实验基础。

但本次实验未能检测BALB/c小鼠背部皮肤中IL-18以及IL-22的表达水平，仅从小鼠外周血清中IL-18以及IL-22的表达水平来探讨银屑平丸治疗银屑病的发病机制，不够全面。