PTHrP、MCT1信号通路对非小细胞肺癌细胞衰老的调节机制研究

贺黎升　马丽梅　罗金风　段艳

[摘要] 目的 研究探討甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）、单羧酸转运泵家族1（MCT1）信号通路对非小细胞肺癌衰老的调节机制。方法 将2014年5月—2018年5月在该医院培养的80孔非小细胞肺癌A549细胞分为A、B、C、D共4组，每组20孔。其中A组细胞中加入PTHrP信号通路抑制剂、B组细胞加入MCT1信号通路抑制剂、C组细胞加入PTHrP信号通路激活剂、D组细胞加入等量的PBS培养液，4组细胞经联系72 h培养。采用β-半乳糖苷酶染色法（β-Gal）观察4组细胞的衰老程度。对4组细胞进行PCR扩增，以实时荧光定量PCR方法检测PTHrP mRNA、MCT1 mRNA的表达量。并对各组细胞中pHi染色小体的和细胞外乳酸水平进行检测比较。并采用Pearson检验对各指标间进行相关性分析。结果 ①4组细胞间β-Gal染色阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05），其中A组、B组阳性率（13.98±2.53）%、（14.23±3.21）%均高于D组（10.09±2.98）%，C组阳性率（8.29±2.10）%则低于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。②4组细胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量比较差异有统计学意义（P<0.05），其中A组、B组PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量[（7.09±1.53）、（5.29±1.22）;（7.26±1.61）、（4.98±1.17）]低于D组[（9.13±1.98）、（7.19±1.68）]，而C组表达率[（12.32±2.09）、（9.57±1.98）]则高于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。③4组细胞的pHi染色小体的和细胞外乳酸水平比较有统计学差异，A组、B组pHi染色小体水平高于D组，C组则低于D组，A组、B组细胞外乳酸水平低于D组，C组则高于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。④ Pearson相关性检验显示，各组细胞的β-Gal染色阳性率（即衰老程度）与PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量呈负相关性，与pHi染色小体水平呈正相关性，与细胞外乳酸水平呈负相关性（P<0.05）。结论PTHrP、MCT1信号通路状态可以对非小细胞肺癌细胞的衰老起到调节作用，PTHrP、MCT1间相互影响，共同调节肺癌细胞的乳酸转运过程。

[关键词] 非小细胞肺癌;细胞衰老;甲状旁腺激素相关蛋白;单羧酸转运泵家族1

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）07（c）-0030-04

Regulatory Mechanism of PTHrP and MCT1 Signaling Pathway on Senescence of Non-small Cell Lung Cancer Cells

HE Li-sheng1， MA Li-mei2， LUO Jin-feng1， DUAN Yan1

1.Department of Pathology， Shenzhen People's Hospital， Shenzhen， Guangdong Province， 518020 China; 2.Department of Pathology， Third People's Hospital of Zigong City， Zigong， Sichuan Province， 643020 China

[Abstract] Objective To investigate the regulation mechanism of parathyroid hormone-related protein （PTHrP） and monocarboxylate transport pump family 1 （MCT1） signaling pathway on the senescence of non-small cell lung cancer. Methods The A549 cells of 80-well non-small cell lung cancer cultured in People's Hospital from May 2014 to May 2018 were divided into 4 groups： A， B， C， and D， each with 20 holes. In group A， PTHrP signaling pathway inhibitor was added， group B cells were added with MCT1 signaling pathway inhibitor， group C cells were added with PTHrP signaling pathway activator， group D cells were added with equal amount of PBS medium， and four groups of cells were cultured for 72 h. The degree of senescence of the four groups of cells was observed by β-galactosidase staining （β-Gal）. Four groups of cells were subjected to PCR amplification， and the expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The pHi staining and extracellular lactate levels in each group of cells were detected and compared. Correlation analysis was carried out between the indicators using the Pearson test. Results 1.There was a statistically significant difference（P<0.05） in the positive rate of β-Gal staining between the four groups. The positive rate of group A and group B （13.98±2.53）% and （14.23±3.21）% were higher than those of group D （10.09±2.98）%. The positive rate of group C （8.29±2.10）% was lower than that of group D， and there was significant significant difference between the groups （P<0.05）. 2.The expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA in the four groups of cells were statistically significant（P<0.05）. The expression levels of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA in group A and group B were （7.09±1.53）， （5.29±1.22）; （7.26±1.61）（4.98±1.17）]， lower than group D [（9.13±1.98）， （7.19±1.68）]， and the expression rate of group C [（12.32±2.09）， （9.57±1.98）]， higher than group D， and there were significant significant differences between the groups （P<0.05）. 3.There were significant significant differences in pHi staining and extracellular lactate levels between the three groups of cells. The pHi staining level of group A and group B was higher than that of group D， and that of group C was lower than that of group D， group A and group B. The level of external lactate was lower than that of group D， and that of group C was higher than that of group D. There was statistically significant difference between groups （P<0.05）. 4.Pearson correlation test showed that the positive rate of β-Gal staining （ie， aging） of each group was negatively correlated with the expression of PTHrP mRNA and MCT1 mRNA， and positively correlated with the level of pHi staining， and the level of extracellular lactate of negative correlation （P<0.05）. Conclusion The state of PTHrP and MCT1 signaling pathway can regulate the senescence of non-small cell lung cancer cells. PTHrP and MCT1 interact with each other to regulate the lactic acid transport process of lung cancer cells.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Cell senescence; Parathyroid hormone-related protein; Monocarboxylic acid transport pump family 1

肺癌是临床上发病率较高的恶性肿瘤疾病，对人类健康的威胁性很大，在众多的肺癌患者中以非小细胞肺癌最为多见，约占肺癌临床患者的80%左右。随着对人类生命健康威胁程度的加深，研究人员对非小细胞肺癌发病、病情进展等机制的研究不断深入，其中非小细胞肺癌的癌细胞衰老过程的引起了更多的关注[1]。相关报道显示[2-3]，非小细胞肺癌患者体内的一些转运蛋白、生物标记物的水平的改变会对患者癌细胞的衰老过程发挥一定的作用。其中，甲状旁腺激素相关蛋白（Parathyroid hormone related protein， PTHrP）、单羧酸转运泵家族1（Monarboxylic acid transfer pump family 1， MCT1）信号通路开放过程可能对非小细胞肺癌衰老过程有一定的调控作用[4-5]。为了进一步证实这一临床推断，以便更好地了解非小细胞肺癌细胞的凋亡机制，以期能够为该类癌症的治疗提供依据。在该研究选取2014年5月—2018年5月该医院提供培养得到的80孔非小细胞肺癌A549细胞，分别加入THrP信号通路抑制剂、MCT1信号通路抑制剂、PTHrP信号通路激活剂，观察其对癌细胞衰老的影响，现报道如下。

1  材料与方法

1.1  材料和仪器

材料：非小细胞肺癌A549细胞购自于中科院上海細胞生物研究所;PTHrP、MCT1试剂盒、RNA提取试剂盒、β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色试剂盒、乳酸检测试剂盒等均购置于赛默飞世尔科技有限公司。仪器：KS48型PCR扩增仪（冠森生物科技（上海）有限公司）;A8543紫外分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）;CX-31型电子显微镜（日本奥林巴斯）。

1.2  研究方法

取非小细胞肺癌A549细胞80株分为A、B、C、D共4组，其中A组细胞中加入PTHrP信号通路抑制剂、B组细胞加入MCT1信号通路抑制剂、C组细胞加入PTHrP信号通路激活剂、D组细胞加入等量的PBS培养液，4组细胞经联系72 h培养。对各种细胞培养后进行β-Gal染色，经漂洗、固定、孵育48 h后于显微镜下观察，在视野下观察并随机选取100个染色细胞，测定每个细胞中的染色面积并与细胞总面积进行对比，取比值作为染色阳性率，即表示为细胞的衰老程度。然后采用荧光定量PCR扩增技术检测各组细胞中的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达水平。并采用荧光分光光度法对各组细胞的pHi染色小体的和细胞外乳酸水平。各检查方法均严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。

1.3  评价指标

对4组细胞的β-Gal染色阳性率、PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量、细胞pHi、乳酸水平进行统计比较，并对β-Gal染色阳性率与PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量、细胞pHi、乳酸水平间相关性进行分析探讨。

1.4  统计方法

数据处理采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析，计量资料、计数资料分别用（x±s）、[n（%）]表示，组别比较分别采用t检验/F检验、χ2检验，相关性分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  各组β-Gal染色阳性率比较

4组细胞间β-Gal染色阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05），其中A组、B组阳性率均高于D组，C组阳性率则低于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2  各组PTHrPmRNA、MCT1mRNA表达量比较

4组细胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量比较差异有统计学意义，其中A组、B组PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量低于D组，而C组表达率则高于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3  各组细胞pHi、乳酸水平比较

4组细胞的pHi染色小体的和细胞外乳酸水平比较有统计学差异，A组、B组pHi染色小体水平高于D组，C组则低于D组，A组、B组细胞外乳酸水平低于D组，C组则高于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.4  Pearson相关性分析

Pearson相关性检验显示，各组细胞的β-Gal染色阳性率（即衰老程度）与PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量呈负相关性，与pHi染色小体水平呈正相关性，与细胞外乳酸水平呈负相关性（P<0.05），见表4。

3  讨论

PTHrP、MCT1是两种人体常见的生物标记蛋白，其中PTHrP为甲状旁腺激素相关蛋白，是甲状腺内分泌过程形成的一种蛋白标记物，其在各种癌细胞凋亡过程中发挥重要的信号通路的介导作用[6-7]。具体的主要是通过影响癌细胞的细胞周期性，并由此对癌细胞的增殖、生长及凋亡过程产生一定的作用，当其在体内的水平升高时，PTHrP信号通路大量被激活，癌细胞的增殖生长过程加快，反之当PTHrP水平下调时，PTHrP信号通路关闭，癌细胞增殖生长过程被抑制，加速了癌细胞的衰老和凋亡过程[8]。这种PTHrP信号通路的调节过程的变化能够调节肿瘤细胞的生长能力，并可能改变肿瘤的侵袭转移能力和肿瘤细胞的衰老过程[9]。MCT1是单羧酸转运泵家族中的一种，主要分布在患者体内癌细胞的表面，对癌症患者的癌细胞的乳酸有较好的亲和力，通过与乳酸结合后的跨膜转运过程，从而加速肿瘤细胞的代谢，调节肿瘤细胞衰老凋亡过程[10]。

在该研究中，4组细胞间β-Gal染色阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05），其中A组、B组阳性率（13.98±2.53）%、（14.23±3.21）%均高于D组（10.09±2.98）%，C组阳性率（8.29±2.10）%则低于D组，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。进一步的PCR扩增结果显示，4组细胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量比较差异有统计学意义（P<0.05），其中A组、B组PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量低于D组， C组表达率则高于D组。而4组细胞的pHi染色小体的和细胞外乳酸水平比较差异有统计学意义，A组、B组pHi染色小体水平高于D组，C组则低于D组，A组、B组细胞外乳酸水平低于D组，C组则高于D组。以上结果均表明PTHrP、MCT1水平增加，相应的信号通路被激活，导致β-Gal染色阳性率降低，衰老细胞表达减少。这与李永頔等[11]学者在相关实验中得出，细胞中加入PTHrP信号通路抑制剂的β-Gal染色阳性率（13.65±2.47）%、细胞加入MCT1信号通路抑制剂的β-Gal染色阳性率（13.68±3.31）%、细胞加入PTHrP信号通路激活剂的β-Gal染色阳性率（8.35±2.05）%、细胞加入等量的PBS培养液的β-Gal染色阳性率（10.15±2.30）%的结果相近。当加入PTHrP、MCT1抑制剂后，衰老细胞显著增加，加速癌细胞的凋亡[12]。而各组细胞的PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量、pHi染色小体水平、外周乳酸水平的变化，表明了这些指标的表达过程参与了PTHrP、MCT1信号通路对癌细胞衰老凋亡的影响过程[13-14]。相关性检验结果显示，各组细胞的β-Gal染色阳性率与PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达量呈负相关性，与pHi染色小體水平呈正相关性，与细胞外乳酸水平呈负相关性，进一步表明癌细胞衰老过程受PTHrP、MCT1信号通路调控，并与PTHrP mRNA、MCT1 mRNA表达、pHi染色小体和细胞外乳酸水平相关。

综上所述，当非小细胞肺癌患者体内PTHrP、MCT1信号通路被激活，mRNA表达量显著增加，进一步导致细胞pHi水平降低，外周乳酸水平升高，进而使得非小细胞肺癌患者衰老细胞数量降低。因此，通过对PTHrP、MCT1信号通路状态的抑制条件，共同抑制肺癌细胞的乳酸转运过程，加速非小细胞肺癌细胞的衰老。

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（收稿日期：2019-04-25）