QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱法测定面膜中10种荧光增白剂

2019-09-27张虹艳邱国玉吴福祥许晓辉王小乔朱天虹李晨曦

分析测试学报 2019年9期

张虹艳，邱国玉，吴福祥，许晓辉，王小乔，朱天虹，李晨曦

(兰州市食品药品检验所,甘肃兰州 730050)

荧光增白剂(FWAs)是一种荧光染料，或称为白色染料，是一类复杂的有机化合物，其特性是激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的效应，使肉眼看到的物质颜色很白，从而起到增白的作用[1]，被广泛用于造纸、塑料、皮革、纺织、洗涤等行业[2]。为达到更好的美白效果，一些化妆品生产厂家向面膜中添加FWAs，但如果长期过量接触荧光增白剂，则存在潜在的致癌性[3]。FWAs通常分为水溶性和脂溶性两类，其中水溶性的FWAs较易用清水冲洗，而脂溶性的FWAs则易迁移到皮肤的角质层或血液里，导致肌肤排异，产生过敏反应，重则诱发癌症[4]。目前，我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)中未对FWAs的检测方法和使用作出明确规定，也未见相关的国家和行业标准，仅福建省日用化妆品商会2018年发布的《4T/FDCA/001-2018化妆品包装材料中可迁移荧光增白剂的测定》中采用暗箱式紫外分析仪(紫外灯)对化妆品中FWAs进行定性分析，但未对FWAs的种类和含量进行测定。

FWAs的检测方法主要为光谱法(包括紫外灯照射、紫外分光光度法、荧光分光光度法等[5])和色谱法(包括液相色谱法[6-13]、液相色谱-质谱联用法[14-17]等)。但光谱法只能进行定性或者半定量分析，对于化学结构相似的化合物定性准确度低；液相色谱法只能采用保留时间定性，对组分的分离有较高要求，并且易受杂质干扰，方法灵敏度较低。液相色谱-质谱联用法采用保留时间和特征离子对进行定性和定量分析，具有准确度高和灵敏度高的优势。目前，对化妆品中FWAs的检测研究鲜见报道，仅许江红等[18]采用SPE-UPLC-MS/MS研究了化妆品中的荧光增白剂。基于此，本研究采用QuEChERS技术结合高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法对面膜中化学结构属吡唑啉类型的FWAs(C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368)和化学结构属三嗪氨基二苯乙烯型的FWAs(C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220)进行分析，可为化妆品中FWAs检验标准的制定提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

6460三重四极杆液质联用仪(美国安捷伦公司)；5810R冷冻离心机(德国艾本德股份公司)；R-12平行溶剂浓缩蒸发仪(瑞士步琦有限公司)；VORTEX KB-3涡旋振荡器(中国海门其林贝尔仪器制造有限公司)，MS105DU电子天平(美国梅特勒公司)。

10种荧光增白剂标准品：C.I.393(纯度≥99.7%)、C.I.135(纯度≥99.8%)、C.I.185(纯度≥98.1%)、C.I.367(纯度≥99.9%)、C.I.162(纯度≥95%)、C.I.368(纯度≥97.9%)购于上海安谱公司；C.I.71(146 μg/mL)、C.I.113(108 μg/mL)、C.I.353(103 μg/mL)、C.I.220(101 μg/mL)为购于福州绿川生物科技有限公司的混合对照品。甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)，PSA、C18(Welch公司)。

1.2 标准溶液配制

准确称取10种FWAs标准品，配成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液(C.I.367、C.I.393、C.I.368用三氯甲烷溶解，C.I.135、C.I.185、C.I.162、C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220用乙腈溶解)，于-18 ℃冰箱中避光保存。

采用基质加标法配制标准工作曲线溶液，分别移取10种荧光增白剂标准储备液适量于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈配成C.I.393、C.I.368质量浓度为1 μg/mL，C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162质量浓度为100 ng/mL，C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220质量浓度为50 μg/mL的混合标准中间液;称取与试样基质相应的阴性样品，加入混合标准中间液适量，与样品同步进行提取和净化。

1.3 样品前处理

通过紫外灯照射发现，多数荧光增白剂吸附于面贴膜的载体(基膜)，故将面贴膜的载体(基膜)作为研究对象，将其剪成5 mm×5 mm大小见方，混合均匀。准确称取上述样品2.0 g(精确至0.01 g)置于50 mL具塞比色管中，加入10 mL水和10 mL乙腈，再加入2.0 g NaCl和4.0 g 无水MgSO4，涡旋振荡5 min，以0 ℃ 12 000 r/min离心5 min，上层清液转移至已提前放入200 mg C18、600 mg PSA的离心管中，涡旋振荡5 min，以0 ℃ 12 000 r/min离心5 min，上清液移至玻璃管中，于40 ℃平衡定量浓缩仪中浓缩至近干。残留物加1.0 mL乙腈涡旋溶解，过0.22 μm滤膜，待高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流动相:A为10 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.0 min，90% A；1.0～2.0 min，90%～50% A；2.0～4.0 min，50%～10% A；4.0～6.0 min，10% A；6.0～8.0 min，10%～90% A；8.0～10.0 min，90% A。

质谱条件：电喷雾离子(ESI)源；多反应监测(MRM)模式检测；雾化气温度：325 ℃；雾化器流速：6 L/min，喷雾电压：45 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min。其余质谱参数见表1。

表1 10种荧光增白剂的CAS号、化学式、保留时间、定性离子信息、碎裂电压、碰撞能和极性信息Table 1 CAS No.,chemical formula,retention time(RT),quanlitative ions,fragmentor,CE and polarity of the ten FWAs

*quantitative ion(定量离子)

图1 6种正离子FWAs总离子流图Fig.1 TIC of six FWAs of positive mode standard solution1.C.I.162;2.C.I.367；3.C.I.393；4.C.I.185；5.C.I.135；6.C.I.368

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

在相同色谱条件下对比安捷伦SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和资生堂MGⅢ(2.0 mm×100 mm,3 μm) 2种色谱柱对10种荧光增白剂的分离效果。结果表明，4种负离子扫描模式下的荧光增白剂(C.I.73、C.I.113、C.I.353、C.I.220)在2种色谱柱上均能实现基线分离，分离度良好;6种正离子扫描模式的荧光增白剂(C.I.162、C.I.367、C.I.393、C.I.185、C.I.135和C.I.368)在MGⅢ色谱柱上不能完全分离，其中C.I.367和C.I.393、C.I.185和C.I.135难以实现基线分离；而SB-C18色谱柱对此6种荧光增白剂均有较好的保留特性(图1)。

2.2 流动相的优化

分别比较了10 mmol/L乙酸铵-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈和水-乙腈3种流动相体系梯度洗脱对10种荧光增白剂响应值和分离度的影响。结果显示，以0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脱时的响应值较低，以水-乙腈梯度洗脱时，10种荧光增白剂的响应值和分离度均不佳；而采用10 mmol/L乙酸铵-乙腈进行梯度洗脱，10种荧光增白剂的响应值显著增加，峰形和分离度均得到显著改善，因此选择10 mmol/L乙酸铵-乙腈作为流动相进行梯度洗脱。

2.3 质谱条件的优化

质谱参数通过Optimizer软件对10种荧光增白剂的单标进行自动优化，C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368的响应值在正离子模式下显著高于负离子模式；C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220的响应值在负离子模式下显著高于正离子模式。采用Scan模式进行一级质谱扫描，找到相应的分子离子峰，以分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描，选择响应值最高的两个离子分别作为定量和定性离子对。10种荧光增白剂的定性(黑色)、定量(蓝色)离子对色谱图见图2。

2.4 前处理条件的优化

以面贴膜为实验材料，添加10种荧光增白剂的混合标准溶液(其中C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368的添加水平为10 μg/kg，C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220的添加水平为10 mg/kg)，进行前处理优化。

图3 不同提取溶剂对10种FWAs回收率的影响Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of ten FWAs

2.4.1 提取溶剂的选择实验考察了0.5%氨水-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙腈3种常用溶剂的提取效率(图3)。结果显示，对于正离子扫描模式下的6种荧光增白剂(C.I.393、C.I.135、C.I.185、C.I.367、C.I.162、C.I.368)，响应值顺序依次为0.1%甲酸-乙腈>乙腈>0.5%氨水-乙腈。而对于负离子扫描模式的4种荧光增白剂(C.I.71、C.I.113、C.I.353、C.I.220)，响应值高低顺序为0.5%氨水-乙腈>乙腈>0.1%甲酸-乙腈。这是因为，0.1%甲酸-乙腈可提高样品溶液中H+浓度，有助于提高正反应模式下离子化效率，进而使6种正离子扫描模式的荧光增白剂响应值显著增高；0.5%氨水-乙腈可促进酸性化合物电离，有助于提高负反应模式下离子化效率，进而使负离子扫描模式下的4种荧光增白剂响应值显著升高。综合考虑，兼顾本实验同时进行正、负离子扫描，选择乙腈为提取溶剂。

2.4.2 盐加入量由于提取过程中，使用乙腈溶液和水溶液，向样品中加入无机盐(NaCl和无水MgSO4)，可以促进分层，进而促使待测物质进入有机相，提高提取效率。实验考察了NaCl的添加量(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 g)和无水MgSO4的添加量(0.0、1.0、2.0、4.0、6.0 g)对提取效率的影响(图4)。结果显示，当NaCl加入量为2.0 g时，盐析效率最高，10种荧光增白剂的回收率最高；无水MgSO4加入量为4.0 g时，除水效果最好，10种荧光增白剂的回收率最高。因此选择NaCl和无水MgSO4的加入量分别为2.0、4.0 g。

图4 不同NaCl(A)和MgSO4(B)用量对10种FWAs回收率的影响Fig.4 Effect of different NaCl(A) and MgSO4(B) amounts on the recoveries of ten FWAs

2.4.3 吸附剂用量实验分别考察了吸附剂(C18和PSA)用量对净化效果的影响，C18和PSA总量为800 mg，比较了0 mg C18+800 mg PSA、200 mg C18+600 mg PSA、400 mg C18+400 mg PSA、600 mg C18+200 mg PSA、800 mg C18+0 mg PSA 5种吸附用量的净化效果。结果显示，200 mg C18+600 mg PSA净化时10种荧光增白剂的回收率最优。

2.4.4 离心条件的优化采用冷冻高速离心机，考察了0、4、10、25 ℃离心温度下，转速分别为4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 r/min下的回收率。结果显示，由于面膜膜材密度小，在溶液中不易沉淀，离心温度越低、转速越高，分层效果越好，有助于彻底除杂。因此选择温度为0 ℃，转速为12 000 r/min为样品离心条件。

2.5 基质效应评价

实验采用相同浓度的基质标准溶液和溶剂标准溶液分别进样3针，计算化合物的基质效应(ME=基质标准平均响应值/溶剂标准平均响应值)。若ME=1.0表示不存在基质效应，0.81.5为强基质效应[19]。结果显示，绝大多数荧光增白剂为中等基质效应和强基质效应(表2)，这是由于化妆品中含有表面活性剂、天然植物成分、光稳定剂、抗氧化剂、防腐剂等多种添加剂，同时含有亲水和亲脂成分，共流出物较多，对目标分析的离子化有抑制作用。为消除基质效应的影响，确保定量分析的准确性，采用基质匹配标准溶液绘制线性方程。

2.6 线性范围、检出限及定量下限

按“1.2”方法配制基质匹配标准溶液，以待测物定量离子对的峰面积(Y)为纵坐标,对应质量浓度(X,ng/mL)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，10种荧光增白剂在一定的质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99，以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)，以S/N=10计算定量下限(LOQ)，结果见表2。与液相色谱法测定护肤水中荧光增白剂[4]的文献相比，C.I.162(正离子扫描模式)的检出限、定量下限至少降低3个数量级，C.I.71、C.I.113、C.I.220(负离子扫描模式)的检出限、定量下限至少降低5倍，表明该方法的灵敏度高、准确性好，更适用于痕量物质的检测。