卵巢上皮性癌组织中m iR-338-3p的表达

张瑞涛，史惠蓉，刘哲颖，张微微，姬鹏程，王文文

郑州大学第一附属医院妇科郑州450052

微小RNA(microRNAs，miRNAs)突变和异常表达与多种人体肿瘤的发生、发展相关，miRNAs可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤细胞的恶性生物学行为中发挥重要作用［1］。研究［2-3］表明，在胃癌和结直肠癌组织中miR-338-3p的表达水平明显低于相应的正常组织，miR-338-3p可能与胃癌和结直肠癌患者预后不良相关。目前，有关miR-338-3p在卵巢上皮性癌组织中表达的报道较少，本研究采用qRTPCR技术检测miR-338-3p在正常卵巢、良性卵巢上皮性肿瘤及卵巢上皮性癌组织中的表达情况，分析其表达与卵巢癌临床病理参数之间的关系，探讨其临床意义。

1 材料与方法

1．1 标本来源 收集郑州大学第一附属医院妇科2012年10月至2015年10月随访资料完整的105例手术新鲜卵巢组织标本，其中正常卵巢组织20例，年龄32～69 岁，BMI为20．23 ～31．45 kg/m2;良性卵巢上皮性肿瘤组织20例(浆液性囊腺瘤16例，黏液性囊腺瘤4例)，年龄30～72岁，BMI为21．19～32．28 kg/m2;卵巢上皮性癌组织65例，年龄28～76岁，BMI为20．48 ～35．46 kg/m2。3 组患者的年龄、BMI等一般资料均衡。本研究获得患者或家属知情同意，并经郑州大学第一附属医院道德伦理委员会批准。入组卵巢上皮性癌患者中位年龄50岁。早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者12例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)患者53例;临床分期(FIGO 2014):Ⅰ期8例，Ⅱ期4例，Ⅲ期48例，Ⅳ期5例;组织分化:高分化38例，低分化27例;组织类型:浆液性癌52例，黏液性癌13例;有腹水49例，无腹水16例;有淋巴结转移者32例，无淋巴结转移者33例。卵巢上皮性癌患者术后依据临床分期均接受规范化疗(多西他赛联合顺铂或卡铂)3～6个疗程，耐药或复发患者采用二线化疗药物(多西他赛、吉西他滨、依托泊苷、脂质体、阿霉素、奥沙利铂等)单药或联合化疗。

1．2 主要试剂 Trizol为美国Invitrogen公司产品，Taqman miRNA反转录试剂盒为美国Applied Biosystems公司产品，Revert aid first strand cDNA合成试剂盒为加拿大Fermentas公司产品，SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司。

1．3 m iR-338-3p的qRT-PCR检测 Trizol提取组织总RNA，纯化后以分光光度计定量，取2μg总RNA，参照miRNA反转录试剂盒说明书进行反转录操作，反转录产物参照SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR反应，以U6为内参。PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1，PCR反应体系为:SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μL、上下游引物各 0．8 μL、ROX Reference Dye 0．4 μL、cDNA 模板 2 μL、ddH2O 6 μL，总体积 20 μL。PCR反应条件为:95℃预变性10 min;95℃变性15 s，60℃退火60 s，共40个循环。实验重复3次，相对表达量采用 2－ΔΔCt计算。

表1 引物序列

1．4 生存分析 随访截至2018年2月底。入组65例卵巢癌患者随访时间为16～61个月，中位随访时间38个月，研究分析的终点事件分别为死亡和无进展生存。死亡时间定义为随访开始至因肿瘤原因而引起死亡的时间;无进展生存时间定义为随访开始至因肿瘤原因引起的进展或复发时间。

1．5 统计学处理 使用 SPSS 21．0和 GraphPad Prism 7软件进行数据分析和绘图，miR-338-3p在不同卵巢组织中表达的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验;以卵巢上皮性癌组织中miR-338-3p表达水平的中位数为依据，高于中位数的为高表达，低于中位数的为低表达。miR-338-3p表达与卵巢上皮性癌临床病理参数的关系采用χ2检验或Fisher精确概率法。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验分析miR-338-3p表达对卵巢癌患者生存的影响，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 不同卵巢组织中m iR-338-3p的表达 卵巢上皮性癌组织中miR-338-3p的表达明显低于正常卵巢组织和良性卵巢上皮性肿瘤组织，见表2。

表2 不同卵巢组织中m iR-338-3p的表达

2．2 卵巢上皮性癌组织中m iR-338-3p表达与病床临床病理参数的关系 临床分期越晚、组织分化高、有淋巴结转移的卵巢上皮性癌组织中miR-338-3p的表达较低(表3)。

2．3 Kap lan-M eier生存分析 miR-338-3p低表达卵巢上皮性癌患者的总体生存率、无进展生存期均短于 miR-338-3p高表达患者(χ2=5．348 和 4．347，P=0．021 和0．037)，见图1、2。

表3 卵巢上皮性癌组织中m iR-338-3p表达与临床病理参数之间的关系 例(%)

图2 不同m iR-338-3p表达的卵巢上皮性癌患者无进展生存曲线比较

3 讨论

卵巢癌是发病率及病死率较高的妇科恶性肿瘤，是威胁女性生殖健康的重要疾病之一，大部分卵巢癌患者发现时临床期别较晚，盆腹腔存在癌灶广泛侵犯和转移，是导致患者治疗效果不佳和预后较差的重要原因之一。

miRNAs是一种内源性非编码小RNA，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，与上皮-间质转化、血管生成、肿瘤细胞微环境等恶性肿瘤侵袭和转移相关过程关系密切，参与包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移等恶性过程，可作为恶性肿瘤治疗的潜在靶点［4-7］。研究［8-13］表明，在胃癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌、结直肠癌、甲状腺癌和神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤细胞中，miR-338-3p可以抑制上述肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移;增加肿瘤细胞中miR-338-3p的表达水平，可逆转上述肿瘤细胞的恶性生物学行为，提示miR-338-3p在上述恶性肿瘤细胞中扮演抑癌基因的角色。

本研究结果显示与正常卵巢组织和卵巢良性上皮性肿瘤相比，卵巢上皮性癌组织中miR-338-3p表达明显降低，临床分期越晚，miR-338-3p表达越低，提示miR-338-3p异常低表达可能与卵巢癌的发生和进展有关。进一步分析显示，miR-338-3p低表达患者的总体生存率和无进展生存期明显缩短，提示miR-338-3p低表达与卵巢癌患者预后不良相关，miR-338-3p可作为卵巢癌预后和复发的标记物。

综上所述，卵巢上皮性癌组织中存在miR-338-3p低表达，且与患者的预后不良相关，可作为卵巢癌预后和复发的标记物。在此基础上深入研究卵巢癌细胞中miR-338-3p靶向调控肿瘤相关基因，参与卵巢癌发病的分子机制，可为临床探寻新的有效治疗卵巢癌的分子靶点，也可为卵巢癌的精准治疗提供新的方向。