沉默FOSL2基因对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

夏先学，陈 路，蔚 芃

川北医学院附属医院骨科四川南充637000

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有高度侵袭性和早期全身转移的特征［1］。近些年已发现一些分子靶点可明显改善骨肉瘤患者临床治疗效果，但仍需寻找更多有效靶点。FOS样抗原2(Fos-related antigen 2，FOSL2)是FOS基因家族成员之一，与Jun亚家族均属于激活蛋白-1转录因子家族，与细胞生长、侵袭和转移、黏附、运动等有关［2］。多种肿瘤组织内FOSL2表达明显高于相邻正常组织。FOSL2可通过与Smad3相互作用促进TGF-β1诱导的非小细胞肺癌迁移［3］;miR-597 靶向FOSL2可抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移［4］;miR-143-3p靶向FOSL2可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移［5］。本研究通过RNAi技术沉默人骨肉瘤细胞MG63细胞中FOSL2表达，旨在探讨沉默FOSL2表达对骨肉瘤细胞生长的影响及其机制。

1 材料与方法

1．1 细胞、试剂和仪器 人骨肉瘤MG63细胞株购自美国ATCC。DMEM/F12培养基、胎牛血清均购自美国HyClone;Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所;Annexin V-FITC/PI检测试剂盒购自南京Keygen公司;FOSL2、PCNA、MMP-2和Bax抗体均购自美国Abcam公司;Transwell小室购自美国Costar公司;酶标仪购自美国Bio-Rad公司;流式细胞仪购自德国Eppendorf公司。

1．2 标本来源 收集川北医学院保存的2016年6月至2018年8月行骨肉瘤穿刺和活检存档的骨肉瘤及相应的肉瘤旁正常组织标本，患者中男26例，女16例，年龄8～53岁，中位年龄20岁。所有患者术前均未行放疗及化疗。

1．3 细胞培养及siRNA转染 MG63细胞常规复苏后，用DMEM/F12完全培养基，于体积分数5%CO2、37℃恒温培养箱常规传代培养。转染参照Lipofectamine2000说明。以5×105个/孔密度将生长至对数期的MG63细胞接种于6孔板，每孔2 mL，细胞达30%～50%的生长密度时转染。细胞分为空白对照组(加生理盐水)、阴性对照组(NC，转染阴性对照siRNA)和siFOSL2-siRNA组(转染FOSL2 siRNA)。制备siRNA和Lipofectamine2000混合液，使siRNA终浓度为100 nmol/L，将混合液加入细胞，于体积分数5%CO2、37℃恒温条件下转染4～6 h，换新鲜培养基继续培养。

1．4 FOSL2、PCNA、MM P-2 和 Bax蛋白的 W estern blot检测 组织标本液氮冷冻状态下研磨后或取转染48 h的MG63细胞，加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照40μg/孔上样蛋白，经SDS-PAGE、转膜、封闭后洗膜。PE手套自制杂交袋，将膜放入袋中，加入稀释好的一抗(FOSL2、PCNA、MMP-2 和 Bax皆按照1∶500稀释)，室温摇床孵育2 h，弃一抗，TBST洗膜，在杂交袋中加入按照1∶3 000稀释的HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h，TBST洗膜，ECL显色。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。实验重复3次。

1．5 细胞增殖实验 使用CCK-8试剂盒检测。选择转染24 h后生长稳定的骨肉瘤细胞，以1×104个/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔。每孔加10μL CCK-8试剂，在体积分数5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱培养，分别于24、48、72和96 h通过酶标仪检测细胞490 nm波长下的吸光度(A)值。实验重复3次。

1．6 细胞凋亡实验 取转染48 h后生长状态良好的细胞，弃上清，PBS漂洗2次，加1～2 mL胰蛋白酶消化细胞使之脱壁，静置5～8 min，轻摇使之形成均匀的细胞悬液，含钙离子的结合缓冲液终止消化，分别加Annexin V-FITC和PI各5μL，轻摇混匀，再加入结合缓冲液350μL，混匀，常温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1．7 细胞侵袭和迁移实验 Transwell小室上室加入50μL稀释好的Matrigel胶，十字摇匀，于37℃培养箱放置40 min。接种转染48 h后的细胞(3×104个/孔)至Transwell小室的上室，每组设置5个复孔，在上室加100μL无血清培养基，下室加500 μL含血清培养基，37℃密闭培养12 h，取出培养板，结晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉签擦拭掉上层未穿过基底膜的细胞，光镜下选择5个视野(×200)，拍照记录并进行穿膜细胞计数。实验重复3次。迁移实验除了未铺Matrigel胶，其他操作同细胞侵袭实验。

1．8 MG63细胞PCNA、MMP-2和 Bax m RNA 表达的qRT-PCR检测 总RNA提取试剂盒提取转染48 h的MG63细胞总RNA，反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，采用qRT-PCR检测细胞中PCNA、MMP-2和Bax mRNA的表达。所有引物由上海生工设计合成。PCR反应体系20μL，其中SYBR Premix Ex Tap 10 μL，上下游引物各0．4 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH2O 7．2 μL。反应条件95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环;65 ℃延长5 min。每个样品设置3个重复，采用2－ΔΔCt法对数据进行相对定量分析，取均值。

1．9 统计学处理 采用SPSS 21．0进行分析，骨肉瘤和肉瘤旁正常组织FOSL2蛋白表达，采用配对t检验，各组细胞增殖、凋亡，侵袭和迁移的差异比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK-q检验，检验水准 α =0．05。

2 结果

2．1 骨肉瘤和肉瘤旁正常组织中FOSL2蛋白的表达 42例骨肉瘤和肉瘤旁正常组织中FOSL2蛋白的相对表达量分别为(0．554±0．049)和(0．114±0．012)，两者比较差异有统计学意义(t配对=15．107，P ＜0．001)，结果见图1。

图1 两种组织FOSL2蛋白的表达

2．2 各组 MG63细胞 FOSL2蛋白的表达FOSL2-siRNA组MG63细胞中FOSL2蛋白表达水平明显降低(P ＜0．05)，结果见图2、表1。

图2 各组MG63细胞中FOSL2蛋白的表达

表1 各组MG63细胞FOSL2蛋白相对表达量比较

2．3 各组MG63细胞增殖情况比较 结果见表2。

表2 各组细胞增殖A值比较(n=3)

2．4 各组MG63细胞凋亡率、侵袭和迁移能力的比较 结果见表3。

表3 各组MG63细胞凋亡率、侵袭细胞数和迁移细胞数的比较(n=3)

2．5 各组MG63细胞中PCNA、MMP-2和Bax的蛋白表达 结果见图3和表4、5。

图3 各组MG63细胞PCNA、MMP-2和Bax蛋白的表达

表4 各组MG63细胞中PCNA、MMP-2和Bax m RNA的表达(n=3)

表5 各组MG63细胞中PCNA、MM P-2和Bax蛋白的表达(n=3)

3 讨论

近些年分子靶向治疗在肿瘤治疗中成为研究热点。FOSL2基因定位于人类2号染色体，在脂肪代谢、骨发育、系统硬化症、癌症等疾病中均发挥重要作用［6］。皮肤T淋巴细胞瘤中FOSL2表达量极高，RNAi技术介导的FOSL2敲除可抑制癌细胞的生长及CCR4和 MYB等致癌基因的表达［7］。已有研究［5］表明miR-143-3p可靶向FOSL2抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移。本研究结果显示，抑制FOSL2表达后骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭和迁移能力明显降低，且凋亡率明显升高，提示FOSL2在骨肉瘤的发生发展中有重要作用。

PCNA是一种可反映细胞增殖程度的理想指标，其表达水平可客观反映肿瘤细胞的增殖状态［8］。有研究［9-10］证实，PCNA 高表达的骨肉瘤患者临床预后差。MMP是一类重要的蛋白酶类，与肿瘤生长、侵袭和转移密切相关，MMP-2是MMP家族成员之一。有研究［11］显示，MMP-2在骨肉瘤等多种肿瘤中表达升高，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Bax是与凋亡相关的Bcl-2家族成员之一，多项研究［12-13］表明，Bax表达上调对骨肉瘤细胞凋亡起促进作用。本研究结果显示，抑制FOSL2表达的骨肉瘤细胞中PCNA和MMP-2表达明显降低，Bax表达明显升高，提示FOSL2对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡影响与调控 PCNA、MMP-2和 Bax表达有关。

综上所述，FOSL2与骨肉瘤细胞活力、侵袭和迁移能力关系密切，机制与下调PCNA、MMP-2表达及上调Bax表达有关。