生长分化因子15-siRNA对人垂体瘤HPAs细胞增殖、侵袭及NF-κB信号通路的影响

吴丹荣，李 红，王 超，高方友

1)贵州医科大学附属医院内分泌及代谢病科贵阳550004 2)贵州医科大学附属人民医院神经外科贵阳550002

垂体瘤是一种颅内良性肿瘤，前叶的腺瘤是较为常见的类型，而侵袭性垂体腺瘤约占垂体腺瘤的10%［1］，具有术后效果差和复发率高等特点。生长分化 因 子 15(growth differentiation factor 15，GDF15)又称巨噬细胞抑制因子、胎盘骨形态发生蛋白、胎盘转化生长因子和前列腺衍生因子，是转化生长因子β超家族成员，在调节组织发育、免疫反应和炎症反应等过程中发挥着重要作用［2-3］。大量研究［4-6］证实，GDF15在子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌等多种肿瘤组织或细胞中异常表达，在细胞增殖、侵袭和转移等过程中发挥着重要作用，与肿瘤的发生发展关系密切。近年来，有研究［7］发现GDF15在垂体腺瘤中高表达，且与垂体瘤侵袭性有关，但其机制并不清楚。本研究将GDF15-siRNA转染至人泌乳素型垂体瘤细胞HPAs中干扰GDF15表达，观察其对垂体瘤细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1．1 主要试剂与仪器 DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，Lipofectamine2000和Trizol试剂购于美国Invitrogen公司。MTT试剂、二甲基亚砜和胰蛋白酶购于美国Sigma公司。VEGF和MMP-9抗体购于武汉博士德公司，β-actin、NF-κB p65 和 p-NF-κB p65 抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。辣根过氧化物酶标记的二抗购于上海康成生物工程有限公司。GDF 15-siRNA(上游5’-CUCAGAGUUGCACUCC GAATT-3’，下游5’-UUCG-GAGUGCAACUCUG AGTT-3’)和阴性对照(NC)-siRNA(上游 5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游 5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’)购于上海吉玛制药技术有限公司。BCA蛋白定量检测试剂盒和细胞裂解液购于上海碧云天生物技术研究所。PVDF膜和Transwell小室购于美国Millpore公司，反转录试剂盒购于加拿大Fermentas公司，ECL试剂购于美国Pierce公司。紫外分光光度计购于美国Pharmacia公司，酶联免疫检测仪和凝胶成像系统购于Bio-Rad公司，PCR仪购于美国ABI公司，CO2细胞培养箱购于美国Thermo公司。

1．2 细胞培养 垂体瘤细胞株HPAs购于中国科学院上海细胞库。将解冻复苏后的细胞接种至加有DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)的25 cm2培养瓶中，置于37℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中常规培养。待细胞长至80%融合时，加入2．5 g/L胰蛋白酶消化传代。

1．3 细胞分组及转染 实验分为对照组(未转染)、GDF15-siRNA组(转染 GDF15-siRNA)和 NC-siRNA组(转染NC-siRNA)，每组设置3个复孔。取生长良好的对数生长期HPAs细胞，以每孔2．5×105个细胞接种至6孔板上，常规培养至细胞融合度达70%以上时进行转染。以无血清DMEM培养基分别稀释siRNA和Lipofectamine2000后，混和制成siRNA/脂质体复合物。参照 Lipofectamine2000说明书将siRNA/脂质体复合物按照实验分组转染至垂体瘤细胞中。转染6 h后，更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。48 h后收集细胞，采用qRT-PCR和Western blot分别检测GDF15 mRNA和蛋白，分析转染效果。

1．4 细胞增殖率检测 将对数生长期的HPAs细胞以每孔104个接种至96孔板上，培养24 h。参照1．3中的分组方法进行处理。每组设置4个复孔，并以不含细胞的培养基作为空白组。分别在培养24、48和72 h后，加入MTT 20μL，4 h后终止培养。弃培养基后，加入二甲基亚砜150μL至MTT结晶完全溶解。采用酶联免疫检测仪在490 nm波长处检测细胞的光密度(OD)值。细胞增殖率=实验组OD/空白组OD×100%。实验重复3次。

1．5 细胞侵袭能力检测 收集转染后的各组细胞，胰蛋白酶消化，以无血清培养基制备密度为103个/mL的细胞悬液。向铺有基质胶的Transwell小室的上室中加入细胞悬液100μL，下室中加入含体积分数10%胎牛血清的培养基。每组设置3个复孔。置于培养箱中常规培养24 h后，取出Transwell小室。甲醛固定15 min，结晶紫染色20 min。以棉签小心擦去基质胶和上室内的细胞，200倍显微镜下选取5个视野，统计穿膜细胞数。实验重复3次。

1．6 qRT-PCR检测GDF15 mRNA的表达 采用Trizol法提取待测细胞的总RNA，并以紫外分光光度计进行浓度及纯度的定量。取1μg总RNA，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA。GDF15上游引物5’-GTTAGCCAAAGACTGCCACTG-3’，下游引物 5’-CCTTGAGCCCATTCCACA-3’，扩增片段大小 105 bp;β-actin 上游引物 5’-GGCGGCAACACCATGTAC CCT-3’，下游引物5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAC T-3’，扩增片段大小202 bp;均由上海生工生物工程有限公司设计、合成。以2μL cDNA为模板，与10 μLMaster Mix、1μL上游引物、1 μL下游引物和6 μL ddH2O配成20μL的PCR反应体系。反应条件:94℃ 预变性6 min;95℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环。以β-actin为内参，采用2－ΔΔCt法计算GDF15 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1．7 W estern blot检测 GDF15、NF-κB p65、p-NF-κB p65、MMP-9和VEGF蛋白的表达 向待测细胞中加入细胞裂解液抽提总蛋白，并参照BCA蛋白定量检测试剂盒说明书对所提取的总蛋白进行定量。经沸水浴变性后，以每孔总蛋白60μg上样至SDS-PAGE凝胶孔中行电泳分离。电转移至PVDF膜上后，采用含50 g/L脱脂奶粉液的TBST封闭液常温封闭2 h。4℃结合特异性一抗反应24 h，常温下结合二抗反应2 h。采用ECL发光显影后，凝胶成像系统采集图像，并对目的蛋白条带进行扫描，以β-actin为内参，以目的蛋白与内参条带灰度值比值表示各目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1．8 统计学处理 采用SPSS 22．0进行统计学分析。不同组间GDF15 mRNA表达水平，细胞增殖率，穿膜细胞数，p-NF-κB p65/NF-κB p65 以及MMP-9、VEGF、GDF15蛋白表达水平的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准 α =0．05。

2 结果

2．1 3组细胞中GDF15蛋白和mRNA表达水平的比较 结果见图1和表1。NC-siRNA组细胞中GDF15蛋白和mRNA的表达水平较对照组无变化，而GDF15-siRNA组细胞中GDF15蛋白和mRNA的表达水平较对照组降低。

图1 3组细胞中GDF15蛋白的表达

表1 3组细胞中GDF15蛋白和m RNA相对表达量的比较(n=3)

2．2 3组细胞增殖率的比较 结果见表2。转染后24、48和72 h，与对照组相比，NC-siRNA组细胞的增殖能力无明显改变，而GDF15-siRNA组细胞增殖受抑。

2．3 3组细胞侵袭能力的比较 结果见表2。与对照组相比，NC-siRNA组细胞侵袭能力无明显改变，而GDF15-siRNA组细胞的侵袭能力受抑。

表2 3组细胞增殖率和穿膜细胞数的比较(n=3)

2．4 3 组 细 胞 中 p-NF-κB p65/NF-κB p65 和MMP-9、VEGF蛋白表达的比较 结果见图2和表3。与对照组相比，NC-siRNA组细胞中NF-κB p65磷酸化水平以及MMP-9、VEGF蛋白的表达无明显改变，而GDF15-siRNA组细胞中NF-κB p65磷酸化水平和MMP-9、VEGF蛋白的表达均降低。

图2 3组细胞中p-NF-κB p65、NF-κB p65、MMP-9 和 VEGF 蛋白的表达

表 3 3 组细胞 p-NF-κB p65/NF-κB p65、MMP-9和VEGF蛋白相对表达水平的比较(n=3)

3 讨论

GDF15基因位于19p12．1-13．1染色体上，编码的蛋白可通过多种途径参与细胞的增殖、侵袭和转移等过程，与肿瘤的发生发展密切相关。有研究［8］发现，结直肠癌患者血清中GDF15水平升高，且其水平与肝脏受累程度以及患者预后关系密切，可作为大肠癌转移的有效生物标志物;同时，GDF15可通过IGF-1R-FoxM1信号通路激活上皮间质转化来促进结直肠癌转移［9］。另外，在宫颈癌组织中GDF15表达升高，并且上调其表达可通过激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路上调CyclinD1、CyclinE1和下调p21表达，从而促进肿瘤细胞增殖［10］。有学者［11］发现在非小细胞肺癌组织中GDF15高表达，而沉默其表达可显著抑制BALB/c裸鼠移植瘤的生长。此外，在肝癌HepG2细胞中GDF15高表达可上调 N-Cadherin、Vimentin、Twist1和下调E-Cadherin蛋白表达，促进HepG2细胞的存活、侵袭、迁移和血管生成，而用GDF15-shRNA干扰其表达后，HepG2细胞的存活、侵袭、迁移和血管生成均明显受到抑制［12］。

研究［7］发现，GDF15在垂体腺瘤组织中表达较高，且与垂体瘤侵袭性相关。本研究通过GDF15-siRNA转染成功下调GDF15表达后，垂体瘤HPAs细胞的增殖和侵袭能力均明显受到抑制，提示GDF15可能在垂体瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥着促进作用。肿瘤的发生发展是一个涉及多种信号通路活化的复杂过程，NF-κB信号通路就是其中之一。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，NF-κB p65是该家族成员中重要的功能性亚单位，磷酸化后可激活NF-κB信号通路，进而调控免疫相关受体、细胞因子和黏附分子等，参与包括垂体瘤在内的多种肿瘤的发生与发展［13］。MMP-9是一种与肿瘤侵袭关系密切的MMP家族成员，在维持降解和重塑细胞外基质的动态平衡过程中发挥重要作用;VEGF是血管形成的重要因子，可通过激活相应受体增加血管通透性和促进细胞增殖;MMP-9和VEGF均是NF-κB信号通路下游相关蛋白，在垂体瘤细胞侵袭和增殖等过程中发挥重要作用［14］。有研究［5］指出，过表达GDF15可通过上调VEGF、MMP-2和MMP-9促进卵巢癌细胞的生长及侵袭;还可通过上调NF-κB、MMP-9的表达促进乳腺癌细胞的增殖与侵袭。该研究发现，GDF15-siRNA能够明显抑制HPAs细胞中NF-κB p65的磷酸化和MMP-9、VEGF的表达。提示 GDF15可通过激活 NF-κB信号通路上调MMP-9和VEGF的表达，进而促进垂体瘤细胞的增殖和侵袭。

综上所述，GDF15在垂体瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，GDF15-siRNA可通过抑制NF-κB信号通路的活化下调MMP-9和VEGF表达，进而发挥抑制垂体瘤细胞增殖和侵袭的作用。