新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

2019-09-26郭莹莹王世状

中国畜禽种业 2019年9期

郭莹莹王世状

（黑龙江省前进农场 156331）

新城疫是由新城疫病毒起地对家禽养殖业危害较大的一种传染性疾病。该病毒传播速度快，比较难控制，是检验检疫中要求严格检验控制的一种病毒。PCR 技术克服了传统的病原分离及常规血清学诊断等方法的费时、费力、敏感性和特异型较差的缺点，已被应用与多种病原微生物的鉴定和检测。为了适应活禽、禽肉制品中，快速、特异的特点，本实验采用“新城疫病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒”，建立快速检测NDV 的荧光RT-PCR 方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

RT-PCR 新城疫诊断试剂盒由北京出入境检验检疫局技术中心和深圳市匹基生物工程股份有限公司联合生产。

试剂：PBS 溶液、氯仿、无水乙醇、异丙醇。

样品A：新城疫病毒，分离自接种病毒鸡体。

样品B：新城疫标准阴性对照，来自试剂盒。

样品CDEFG：新城疫疑似病毒，分离自农户家甲、乙、丙、丁、戊病死鸡体。

样品H：新城疫标准阳性对照，来自试剂盒。

1.2 试验设备

小型离心机、混匀器、冰箱（4℃，-20℃）、荧光PCR 检测仪、台式高速离心机、吸头、1.5mL 灭菌离心管、移液器、记号笔、吸水纸、微量板、镊子。

1.3 方法

1.3.1 病毒RNA 的提取

（1）分别向每瓶样品中加入2mLPBS 溶液，使其充分溶解。

（2）取8 个1.5ml 灭菌离心管，做好标记。

（3）每个离心管加入600μL 裂解液，然后分别加入待测样品、阴阳对照各200μL；再加入氯仿200μL，混匀器上振荡混匀5s。

（4）在4℃条件下，12000g 离心15min。

（5）取与步骤1 中相同数量的1.5ml 离心管，加入400μL异丙醇（-20℃预冷），做好标记。吸取步骤4 各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

（6）12000g 离心15min。轻轻倒去上清，倒置于滤纸上，沾干液体；加入75%乙醇600μL，颠倒洗涤。

（7）12000g 离心10min。轻轻倒去上清，倒置于上吸水纸上，尽量沾干液体。

（8）4000g 离心15min。将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥3min。

（9）加入11μL DEPC 水轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000g 离心5s，冰上保存备用。

1.3.2 扩增试剂准备

（1）从试剂盒中取出相应的RT-PCR 反应液，Taq 酶，在室温下融化后，在2000r/min 离心5s，则所需的PCR 数为16，每个测试体系配制如下，把RT-PCR 反应液和Taq 酶按每个PCR 反应管加15μL 的PCR 和1/4 颗（即一颗加4 个孔）的比例配成反应液。

（2）把试剂盒中的PCR 板条取出，放在微量板上，在各设定的PCR 板条管中分别加入上述病毒提取步骤（9）中制备的RNA 溶液各10μL，盖紧管，使用台式离心机在17℃下9600g离心20min，取出板条，放入荧光PCR 荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。

（3）循环条件设置。

表1 PCR 循环条件程序

仪器检测通道选择F1 通道

（4）结果分析条件设定

读取F1 通道的检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。

2 判定依据

CT 值无数值的为阴性，CT 值≤40.0 的样本为阳性样本。同时，阴性对照的检测结果为阴性，阳性对照的检测结果为阳性。

3 结果

荧光RT-PCR 仪对试验样品的检测结果见表2 和附图。

从表2 和附图可以看出，接种的新城疫病毒，新城疫阳性（试剂盒）为阳性，因为只要是阳性就有对数增长期。所选的几种疑似病例中以农户家里的曲线走的好，从图上的顺序来看，其曲线中较高的一条（C1）高于新城疫接种病毒的较低的一条（A2）。其两条曲线（C1，C2）均高于新城疫阳性对照（H1，H2），这说明它是致病性较强的毒株。而样品D、E、F、G 均为阴性。从本试验中可以得出，疑似病例中只有农户家甲为强毒株，而由其他农户家的疑似病例产生的新城疫病毒均为弱毒株或无毒性。